5.1 Общие положения
В соответствии с установившейся лабораторной практикой всю аппаратуру и оборудование содержат в чистоте и в хорошем рабочем состоянии. Перед использованием оборудование следует проверить в соответствии с инструкцией. В процессе работы оборудование периодически проверяют по определенным характеристикам, указанным в соответствующих инструкциях.
При необходимости оборудование и контрольно-измерительные приборы калибруют в соответствии с действующими национальными стандартами. Выполняют также повторную калибровку и необходимые промежуточные поверки, а проведенные процедуры и результаты калибровок и проверок документируют.
Оборудование регулярно проверяют и проводят сервисное обслуживание, чтобы обеспечить безопасность и пригодность его к использованию. Оборудование проверяют согласно рабочим условиям и точности, требуемой для получения результатов.
Частота калибровки и проверок каждой единицы оборудования в большинстве случаев должна определяться каждой лабораторией в зависимости от типа оборудования и уровня активности лаборатории и в соответствии с инструкциями изготовителя оборудования. В ограниченном числе случаев частота калибровок и проверок увеличивается, если это необходимо для эффективной деятельности лаборатории.
Аппаратуру и оборудование следует сконструировать и установить таким образом, чтобы облегчить работу персоналу и обеспечить выполнение технического обслуживания, очистки, дезактивации и калибровки.
Все неопределенности измерений, приведенные в данном разделе, связаны с рассматриваемой здесь аппаратурой и оборудованием, но не с методом анализа в целом.
В этом разделе установлены требования, предъявляемые к точности измерительного оборудования. Они основаны на практической допустимости отклонений, позволяющей гарантировать контроль оборудования в рабочей деятельности. Установленная точность связана с метрологической неопределенностью прибора.
У приборов, контролирующих температуру, следует проверить стабильность и равномерность распределения температуры перед началом использования и после любого ремонта или их модификации, которые могут влиять на достоверность температурного контроля.
5.2 Бокс биологической безопасности для микробиологических исследований
5.2.1 Описание
Бокс биологической безопасности для микробиологических исследований (далее бокс) - это рабочее помещение, оснащенное установкой для горизонтального и вертикального ламинарных потоков воздуха, предназначенной для удаления пыли и других частиц из воздуха, в том числе микробов.
Максимально допустимое количество частиц в кубическом метре с размером больше или равным 0,5 мкм представляет класс устранения пыли из защитного кабинета с очисткой воздуха. Для кабинетов, используемых в микробиологии пищевых продуктов, количество частиц не должно быть выше 4000 в кубическом метре.
Кабинеты для использования в лабораториях микробиологии пищевых продуктов разделяются на четыре типа:
Если это определено национальными регламентами, боксы биологической безопасности используют для любых видов работы с патогенными микроорганизмами и контаминированными порошками.
В боксах биологической безопасности не допускается использовать газовые горелки или установки для сжигания отходов. В боксах применяют одноразовое оборудование (бактериологические петли, пипетки и т.д.)
Примечание - Газовую горелку применяют при условии создания маленького пламени таким образом, чтобы не нарушить поток воздуха.
5.2.2 Использование
В боксах биологической безопасности не допускается наличие оборудования, которое не применяется в работе.
Все необходимое размещают до начала работы внутри бокса, чтобы свести к минимуму количество движений рук внутри и вне рабочей зоны. Расположение оборудования и материалов должно быть таким, чтобы свести к минимуму нарушение потока воздуха в рабочей зоне.
Операторы должны быть обучены правильному использованию боксов, чтобы обеспечивать как их безопасность, так и сохранность образца или культуры микроорганизмов.
5.2.3 Очистка и дезинфекция
Рабочую зону очищают и обеззараживают после использования с помощью соответствующего, не обладающего коррозийными свойствами дезинфицирующего средства, руководствуясь инструкцией изготовителя. Регулярно обследуют защитные предфильтры проволочных сеток и вытирают их чистой, пропитанной дезинфицирующим средством тканью.
Для ламинарных шкафов с очисткой воздуха наружную часть фильтра необходимо регулярно очищать под вакуумом таким образом, чтобы не повредить фильтрующую среду.
Боксы биологической безопасности должны окуриваться перед заменой фильтра или плановым обслуживанием.
После очистки бокса для обеззараживания можно использовать ультрафиолетовые (УФ) лампы. УФ лампы регулярно очищают или заменяют в соответствии с инструкциями изготовителя.
5.2.4 Техническое обслуживание и контроль
Необходимо использовать боксы биологической безопасности, которые предназначены для применения в лаборатории в соответствии с существующей окружающей средой.
Квалифицированный оператор должен проверять эффективность бокса биологической безопасности при получении и затем с регулярными интервалами, как рекомендует изготовитель, а также после любого ремонта или модификации.
Следует периодически выполнять проверку чистоты рабочей поверхности и стен бокса от любого микробного загрязнения.
Необходимо периодически осуществлять проверку числа микроорганизмов, циркулирующих в воздухе во время работы фильтров, с помощью обычного оборудования. Например, экспонируя несколько открытых чашек Петри, содержащих неселективную агаровую культуральную среду (например РСА), в каждом кабинете в течение 30 мин. Допускается использовать другие методы.
5.3 Весы и гравиметрические разбавители
5.3.1 Использование и неопределенность измерения
Весы используют для взвешивания испытуемой пробы, компонентов питательных сред и реактивов. Кроме того, весы допускается использовать для измерений объемов разведенной жидкости с помощью определения массы.
Гравиметрические разбавители - это электронные инструменты, состоящие из весов и программируемого дозатора жидкости, который применяют для приготовления исходных суспензий проб. В их функции входит добавление разбавителя к первичной пробе в определенном отношении. Пробу взвешивают, далее добавляют разбавитель для получения определенного объема, чтобы получить достаточное разведение для требуемого отношения (например, 9:1 для десятикратных разведений).
Лаборатория микробиологии пищевых продуктов должна быть оборудована весами требуемого диапазона с требуемой неопределенностью для взвешивания различных продуктов.
Если нет других указаний, максимальная допустимая погрешность - не более 1% при взвешивании образцов для анализа.
Оборудование устанавливают на устойчивую горизонтальную поверхность и с защитой от вибраций и сквозняков.
5.3.2 Очистка и обеззараживание
Весы очищают и дезинфицируют после каждого использования или после проливания (рассыпания) при взвешивании с помощью подходящего некоррозирующего дезинфицирующего средства.
5.3.3 Проверка показателей и калибровка
Обученный оператор должен регулярно проверять рабочие характеристики системы взвешивания во время использования и после очистки с помощью контрольных разновесов. Проверку весов проводят по всему диапазону, частота проверки зависит от интенсивности использования.
Контрольные разновесы могут быть проверены также непосредственно после калибровки весов.
5.4 Гомогенизаторы, смесители и миксеры
5.4.1 Описание
Это оборудование используется для получения исходной суспензии из испытуемой пробы для анализа нежидких продуктов.
Необходимо использовать следующую аппаратуру:
В некоторых случаях перемешивание может быть выполнено вручную с использованием стерильных стеклянных бусинок, имеющих соответствующий диаметр (приблизительно 6 мм; см. ISO 6887-2 - ISO 6887-4 и ISO 8261).
5.4.2 Применение
Обычно рабочее время гомогенизатора перистальтического типа составляет от 1 до 3 мин (см. ISO 6887-2 - ISO 6887-4 и ISO 8261 для конкретных пищевых продуктов).
Для некоторых видов пищевых продуктов эту аппаратуру использовать нельзя:
Ротационный гомогенизатор должен использоваться в таком режиме, чтобы общее количество оборотов составляло от 15000 до 20000 об/мин включительно. Даже при использовании самого малого количества оборотов продолжительность работы не должна превышать 2,5 мин.
Вибрационный миксер можно использовать для большинства пищевых продуктов, включая твердые или сухие изделия. Обычное время работы составляет от 0,5 до 1 мин. Если микроорганизмы расположены глубоко внутри клейкой структуры продукта, образец перед обработкой следует разрезать на маленькие кусочки.
Стеклянные бусинки применяют для подготовки исходных суспензий контролируемых вязких или густых продуктов, в частности молочных продуктов (см. соответствующие стандарты на конкретные методы испытаний).
5.4.3 Очистка и обеззараживание
Перистальтические гомогенизаторы и вибрационные миксеры моют и обеззараживают после каждого применения, а также после любого разрыва пакета или протекания.
Ротационные гомогенизаторы моют и стерилизуют после каждого применения.
5.4.4 Техническое Обслуживание
Контроль и техническое обслуживание оборудования - в соответствии с инструкциями изготовителя.
5.5 рН-метр
5.5.1 Описание
рН-метр применяют для измерения при определенной температуре разности потенциалов между измеряющим электродом и электродом сравнения, погруженными в продукт. рН-метр должен обеспечивать измерение с точностью до ±0,05 единицы рН, а его разрешение составлять 0,01 единицы рН.
рН-метр должен быть оснащен ручным или автоматическим определителем температуры.
Примечание - Измерительный электрод и электрод сравнения обычно соединяют в одну систему электродов.
5.5.2 Использование рН-метра
рН-метр используют для измерения значения рН питательных сред и реактивов, а также для проверки их качества после стерилизации.
Прибор может также использоваться для измерения значений рН образцов и суспензий образцов. Использование рН-метра предусматривают в стандарте на конкретный анализируемый продукт, в котором определены условия для измерения значения рН и условия получения нужного значения рН.
рН-метр регулируют в соответствии с инструкцией изготовителя при стандартизированной температуре 25°С. Значение рН учитывают после того, как стабилизируется показание. Значение рН записывают с точностью до двух знаков после запятой.
Примечание - Показание можно считать стабильным, когда значение рН, измеренное в течение 5 с, изменяется не более чем на 0,02 единицы рН. При использовании электродов в хорошем состоянии равновесие обычно достигается в пределах 30 с.
5.5.3 Проверка и контрольное измерение
рН-метр проверяют в соответствии с инструкцией изготовителя, используя не менее двух, а лучше трех стандартных буферных растворов, ежедневно перед началом работы. При этой проверке определяют максимально допустимые погрешности в зависимости от применения.
Буферные растворы должны иметь значения рН, определяемые с точностью до двух знаков после запятой при температуре измерения (рН 7,00, рН 4,00 и/или рН 9,0 при 25°С в соответствии с инструкцией изготовителя). Измеряемое значение рН должно находиться между значениями рН стандартных растворов.
После проверки рН-метра с двумя определенными стандартными буферными растворами рН необходимо проверить, используя третий буферный раствор, обычно именуемый контрольным буферным раствором, например имеющим рН 5 или рН 8.
Когда при проверке устанавливается, что результат находится за пределами максимально допустимой ошибки, выполняют контрольное исследование в соответствии с инструкцией изготовителя.
Измерение может сопровождаться калибровкой, которая позволит оценить неопределенность измерения данного рН-метра.
5.5.4 Обслуживание
Электроды проверяют и поддерживают в удовлетворительном состоянии в соответствии с инструкцией изготовителя. Ежедневно проверяют:
Электроды необходимо ополаскивать дистиллированной или деионизированной водой после каждого использования. Учитывая загрязнение и старение электродов, их регулярно тщательно чистят в соответствии с инструкцией изготовителя.
Электроды хранятся в соответствии с инструкцией изготовителя.
5.6 Автоклав
5.6.1 Описание
Автоклав позволяет поддерживать в камере температуру насыщенного пара и используется для уничтожения (умерщвления) микроорганизмов.
Автоклав должен быть оснащен:
Автоклав должен быть оснащен таймером и устройством для записи температуры.
5.6.2 Использование
При стерилизации водяным паром воздух перед автоклавированием удаляется с помощью увеличения давления. Если автоклав не снабжен автоматическим устройством удаления воздуха, его необходимо вытеснить, пока не начнет выходить непрерывная струя пара.
Для уничтожения (разрушения) микроорганизмов насыщенный пар в камере должен быть при температуре не менее 121°С.
В течение одного и того же цикла стерилизации нельзя использовать автоклав для стерилизации чистого оборудования (и/или питательных сред) и одновременно обеззараживать использованное оборудование (и/или использованные питательные среды).
Предпочтительно использовать отдельные автоклавы для этих двух процессов. После автоклавирования все материалы и оборудование необходимо охладить в автоклаве перед их извлечением.
В целях безопасности нельзя извлекать содержимое из автоклава, пока температура не достигнет 80°С.
5.6.3 Обслуживание
Регулярно моют камеру, сушат фильтр и уплотнители дверцы. Проверяют уплотнители дверцы на целостность. Через определенные интервалы и по мере необходимости выполняют операции по высушиванию и удалению накипи в соответствии с рекомендациями изготовителя.
5.6.4 Проверка и калибровка
Автоклав необходимо содержать в хорошем эксплуатационном режиме и регулярно проверять компетентным квалифицированным персоналом в соответствии с инструкциями изготовителя.
Контрольно-измерительные приборы необходимо поддерживать в порядке и готовности к работе и регулярно их проверять.
Начальная проверка должна включать в себя испытание рабочих показателей для каждого операционного цикла и каждой используемой в практической работе конфигурации загрузки. Этот процесс необходимо повторять после существенного ремонта или модификации прибора. При проверке устанавливают достаточное количество датчиков температуры, чтобы установить адекватное поступление тепла во все рабочие зоны прибора. При проверке и перепроверке необходимо установить как продолжительность времени нагревания, так и периода охлаждения, а также температуру стерилизации.
Там, где отсутствует прослеживаемая эффективность автоклавирования, необходимо при каждой загрузке в ее середину поместить индикатор автоклавирования для проверки процесса нагревания.
5.7 Аппарат для приготовления питательных сред
5.7.1 Описание
Аппарат для приготовления питательных сред разработан преимущественно для стерилизации больших объемов сред (≥1 дм3). Он состоит из нагревающегося сосуда, водяной рубашки и устройства непрерывного перемешивания. Оборудование должно быть оснащено термометром, манометром, таймером и предохранительным клапаном.
Кроме того, прибор должен иметь замок-предохранитель, чтобы предотвратить открывание, пока температура не достигнет менее 80°С.
5.7.2 Использование
Необходимо всегда следовать инструкциям изготовителя.
Процесс приготовления питательных сред происходит только внутри аппарата. После добавления всех компонентов они растворяются посредством размешивания и нагревания. Затем происходит стерилизация.
5.7.3 Обслуживание
Аппарат моют и полностью ополаскивают чистой водой после каждой партии сред.
5.7.4 Проверка
Аппарат для приготовления питательных сред содержат в хорошем рабочем состоянии, регулярно проверяют компетентным квалифицированным персоналом в соответствии с инструкциями изготовителя.
Контрольно-измерительные приборы должны быть в хорошем рабочем состоянии и всегда подготовлены к работе.
Начальная проверка должна включать в себя изучение рабочих показателей для каждого операционного цикла и каждого объема загрузки, используемого в практике. Этот процесс необходимо повторить после значительного ремонта или модификации. Для демонстрации однородности нагревания следует установить два датчика температуры: один - примыкающий к контрольной пробе, а другой - отдаленный от нее.
Необходимо проверять температуру и продолжительность каждого цикла.
5.8 Термостат (инкубатор)
5.8.1 Описание
Термостат состоит из изолированной камеры, которая позволяет удерживать постоянство температуры, однородно распределенной в камере в пределах максимально допустимой температурной ошибки, указанной в методе испытания.
5.8.2 Использование
Термостаты должны быть оборудованы системой регулирования, которая позволяет сохранять температуру или другие параметры постоянными по полному рабочему объему камеры. Чтобы это условие выполнялось, определяют рабочий объем термостата.
Если окружающая температура близка или выше температуры в термостате, необходимо использовать систему охлаждения камеры.
Стенки термостата должны быть защищены от солнечного света.
Термостаты не следует заполнять полностью ни в одном операционном цикле, поскольку питательные среды будут отнимать значительно большее время для достижения постоянства необходимой температуры независимо от типа используемого инкубатора (с принудительно-воздушной вентиляцией или другого типа). Нельзя оставлять дверцы термостата открытыми в течение длительного периода времени.
При загрузке термостатов необходимо проследить за циркуляцией воздуха (см. 10.2.4).
5.8.3 Очистка и санитарная обработка
Регулярно очищают и проводят санитарную обработку внешних и внутренних стенок термостата и, если необходимо, удаляют пыль из системы вентиляции.
5.8.4 Проверка
Проверяют стабильность температуры и однородность распределения температуры в рабочем объеме камеры термостата с помощью одновременного использования нескольких термометров или термоэлементов известной точности в необходимом диапазоне температуры.
Полученную информацию используют для определения приемлемого операционного диапазона термостата и оптимального местоположения термометра для контроля рабочих температур.
Например, чтобы достигнуть необходимой температуры (37±1)°С при данных контроля, который показывает диапазон 36,8°С - 37,3°С в разных частях рабочего объема термостата, рабочий диапазон необходимо уменьшить до 36,2°С - 37,7°С, чтобы обеспечить во всех частях термостата требуемую температуру 37°С.
Этот процесс требуется повторять после каждого значительного ремонта или модификации термостата.
Температуру в процессе работы необходимо проверять с помощью одного или нескольких термометров с выявлением максимальной и минимальной границ диапазона или, например, с помощью записывающих термопар.
Термометр или записывающая термопара, используемые для постоянного контроля качества термостата, необходимо установить в положение, которое определено по данным температурного профиля для достижения необходимой температуры.
Температуру термостата проверяют каждый рабочий день. С этой целью каждый термостат должен включать не менее одного термометра, шарик которого погружен в глицерин (или другое подходящее вещество), находящийся в герметично упакованном сосуде.
Можно использовать другие системы проверки работы с равноценными характеристиками.
5.9 Холодильник, холодная комната (помещение для хранения на холоде)
5.9.1 Описание
Холодильники представляют собой камеры, которые позволяют поддерживать хранение при пониженной температуре. Для хранения проб пищевых продуктов температура должна быть (3±2)°С (максимальные допустимые ошибки), за исключением специальных случаев использования.
Для других вариантов использования температура, если иначе не определено, должна быть (5±3)°С.
5.9.2 Использование
Чтобы избежать перекрестного загрязнения, используют разные камеры, или, по крайней мере, различные контейнеры, достигая тем самым физического разделения, для хранения следующих продуктов:
Загрузку холодильников, холодных камер и холодных комнат проводят таким образом, чтобы поддерживалась необходимая циркуляция воздуха и возможность перекрестного заражения была сведена к минимуму.
5.9.3 Проверка
Температуру каждой камеры проверяют ежедневно, используя термометр или постоянно установленный датчик. Точность, требуемая для контролирующего температурного устройства, зависит от цели, с которой эта камера используется.
5.9.4 Обслуживание и очистка
Выполняют следующие профилактические операции с постоянными интервалами, чтобы обеспечить надлежащую работу оборудования:
5.10 Морозильная камера и низкотемпературная установка для глубокого замораживания
5.10.1 Описание
Морозильная камера - это аппарат, который гарантирует хранение в условиях замораживания. Температура, кроме особо оговоренных случаев, должна быть ниже минус 15°С, предпочтительно ниже минус 18°С для проб пищевых продуктов.
Установка для глубокого замораживания - это камера, которая гарантирует хранение глубокозамороженного продукта. Температура, если иначе не указано, должна быть ниже минус 70°С.
5.10.2 Использование
5.10.2.1 Морозильная камера
Необходимо иметь разные камеры или разные контейнеры с достаточным пространством, чтобы обеспечить физическое разделение при хранении:
Морозильные камеры заполняют таким способом, чтобы поддерживалась достаточно низкая температура, особенно в случаях, когда в них загружают незамороженные продукты.
5.10.2.2 Установка для глубокого замораживания
Морозильные камеры применяют для хранения микроорганизмов, контрольных и/или рабочих культур и реагентов. Загружают их таким способом, чтобы поддерживалась низкая температура и предотвращалось взаимное загрязнение между микроорганизмами и реагентами.
5.10.3 Проверка
Регулярно проверяют температуру каждой камеры, используя подходящие устройства, контролирующие температуру.
5.10.4 Техническое обслуживание
Регулярно выполняют следующие операции для поддержания морозильных камер в рабочем состоянии:
5.11 Баня термостатическая контролируемая
5.11.1 Описание
Баня с терморегулятором, заполненная жидкостью (вода, этилен гликоль и т.д.), с подогнанной крышкой или без нее или другим устройством, ограничивающим испарение, которое требуется, чтобы поддерживать необходимую температуру. Контроль температуры часто более точен, чем в воздушном термостате, и обеспечивает максимально допустимое отклонение ±0,5°С и менее. Рабочие температуры и требуемые максимально допустимые погрешности устанавливают для каждого отдельного метода. Необходима система охлаждения для поддержания температуры, близкой к окружающей температуре или ниже данной температуры.
5.11.2 Использование
В основном баню используют для решения следующих задач:
Там, где требуется точный контроль температуры, баня должна быть оборудована циркуляционным водяным насосом и автоматической системой регулирования температуры. Любое перемешивание жидкости не должно приводить к разбрызгиванию капель.
Для использования при точной или высокой температуре предпочтительны бани с крышками. Следует использовать покатые крышки, создающие условия для стока конденсата.
Для инкубации засеянных питательных сред жидкость в бане поддерживают на уровне, чтобы верхний край питательной среды был на 2 см ниже уровня жидкости в бане в течение времени инкубации.
Другие контейнеры необходимо размещать в бане таким образом, чтобы уровень их содержимого был ниже уровня жидкости.
Глубина погружения должна препятствовать попаданию воды через крышку.
Допускается применять устройства для поддержания контейнеров в стабильном положении, например штативы.
После выемки из бани все контейнеры должны быть высушены перед дальнейшим использованием.
5.11.3 Проверка
Проверке подлежат стабильность и однородность температуры во всех частях бани перед началом использования и после любого ремонта или модификаций, оказывающих влияние на контроль температуры.
Контроль температуры в бане осуществляют с помощью термометра, термоэлементов или устройства регистрации температуры с подходящей минимальной неопределенностью измерения (см. 5.28.2) и независимо от автоматической системы регуляции температуры.
Допускается использовать цифровой дисплей при условии, что его точность и разрешение проверены на соответствие требованиям.
Температуру бани контролируют в течение каждого использования и, как минимум, ежедневно при продолжительной инкубации.
5.11.4 Обслуживание
Бани перед началом работы необходимо заполнить жидкостью, как рекомендуется изготовителем. Для инкубации культур следует использовать дистиллированную или деионизированную воду.
Регулярно проверяют уровень жидкости, чтобы обеспечить правильное функционирование бани и надлежащее погружение помещенных образцов в баню. Уровень жидкости должен всегда закрывать нагревательные элементы.
Жидкость из бань должна регулярно выливаться, баня очищаться, санироваться и снова заполняться жидкостью в зависимости от частоты использования, а также после того, когда происходит разбрызгивание или протекание бани.
5.12 Пароварки, включая бани с кипящей водой
5.12.1 Описание
Пароварки и бани с кипящей водой состоят из нагревательного элемента, окруженного водой в сосуде с плотно подогнанной крышкой. В пароварке при атмосферном давлении образуется пар; в бане с кипящей водой нагревается вода до температуры кипения или близкой к таковой с образованием или без образования пара.
5.12.2 Использование
Данные приборы используются, главным образом, для следующего:
Можно использовать автоклав с автономной парообразущей способностью.
5.12.3 Обслуживание
Пароварки и бани с кипящей водой необходимо содержать в чистоте.
При необходимости следует чистить приборы от накипи с частотой, зависящей от жесткости местной воды.
5.13 Стерилизационный сушильный шкаф
5.13.1 Описание
Стерилизационный сушильный шкаф - это камера, которая способна поддерживать температуру от 160°С до 180°С для уничтожения (разрушения) микроорганизмов с помощью сухого горячего воздуха.
5.13.2 Использование
В стерилизационном сушильном шкафу следует стерилизовать только прочное и твердое оборудование, такое как стеклянная посуда и металлические изделия.
Стерилизационный сушильный шкаф не допускается использовать для стерилизации изделий из каучука и пластмассы.
Перед стерилизацией стеклянной посуды и металлических инструментов их очищают и моют.
При стерилизации мерной стеклянной посуды ее регулярно проверяют на точность маркированных объемов.
Температура в стерилизационном сушильном шкафу должна быть одинаковой во всех частях камеры. Сушильный шкаф должен быть оснащен термостатом и термометром или устройством регистрации температуры.
Сушильный шкаф должен быть оборудован индикатором продолжительности работы, программируемым устройством или таймером.
Как только достигается температура стерилизации, процедура стерилизации должна длиться не менее одного часа при температуре 170°С или поддерживать равноценный режим по параметрам время/температура.
После стерилизации, чтобы предотвратить растрескивание стеклянной посуды, перед ее изъятием из сушильного шкафа необходимо дать время для охлаждения, не вынимая из шкафа.
5.13.3 Проверка
Проверке подлежат стабильность и равномерность распределения температуры во всех зонах шкафа перед началом применения и после любого ремонта или модификации, которая может повлиять на контроль температуры.
Стерилизационный сушильный шкаф должен быть оснащен калиброванным термометром, термопарой или устройством регистрации температуры соответствующей точности, которое является независимым от автоматической системы регуляции температуры.
Контролирующее устройство должно иметь разрешение 1°С или менее при температуре, используемой в сушильном шкафу.
Температуру сушильного шкафа следует проверять и регистрировать в течение каждого цикла использования.
5.13.4 Обслуживание
По мере необходимости моют внутренние поверхности сушильного шкафа.
5.14 Микроволновая печь
5.14.1 Описание
Микроволновая печь - это устройство, в котором нагревание продукта осуществляется с помощью микроволнового излучения при атмосферном давлении.
5.14.2 Использование
Имеющиеся в настоящее время микроволновые печи рекомендуется использовать только для нагревания жидкостей или плавления агаровых питательных сред.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Не допускается нагревание сред, содержащих чувствительные к высокой температуре компоненты, если не проверено, что этот способ нагревания не оказывает влияния на свойства среды. До настоящего времени нет оценки эффективности микроволн для стерилизации питательных сред, и поэтому микроволновые печи не допускается использовать для этой цели.
Микроволновая печь должна обеспечивать нагревание жидкостей и питательных сред с помощью цикла микроволнового излучения. Микроволновое поле должно быть гомогенным и равномерно распределенным по объему, чтобы избежать зон перегревания. Микроволновые печи, оснащенные поворотным столом или смесителем для микроволн, характеризуются лучшим распределением высокой температуры.
Нельзя использовать металлическое оборудование, включая металлические крышки. Крышки флаконов или пробки перед нагреванием в микроволновой печи необходимо приоткрыть.
Нагревание в течение более длинных периодов времени при меньшей номинальной мощности может обеспечить лучшее распределение высокой температуры.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Проводите нагревание изделий с осторожностью. Содержимое сосудов может перегреваться и выкипать, возможен взрыв флаконов.
Плавление агаровых питательных сред проводят при низкой мощности (например, режим размораживания), и нагревание воды (например, от 50 до 100 см3 воды в лабораторном стакане для микроволновой печи) рекомендуется для дополнительного контроля процесса нагревания.
После процесса нагревания следует подождать не менее 5 мин перед удалением содержимого из микроволновой печи.
5.14.3 Проверка
Необходимо определить подходящие время нагревания и мощность при первоначальном использовании микроволновой печи для различных объемов жидкостей и питательных сред, с которыми обычно работают в лаборатории. Таким образом обеспечивают оптимальный режим, при котором не происходит перегрев чувствительных продуктов.
5.14.4 Обслуживание
Печь немедленно очищают и моют при малейшем попадании брызг, а также через регулярные интервалы в зависимости от интенсивности использования.
Регулярно осматривают целостность уплотнителя двери печи, а печь регулярно проверяют на потерю излучения.
5.15 Машина для мытья стеклянной посуды
5.15.1 Описание
Лабораторные машины для мытья стеклянной посуды - это машины с электронным управлением, которые можно программировать на различные режимы мойки и полоскания (например, дистиллированной или деионизированной водой или кислотой).
Лабораторные машины для мытья стеклянной посуды могут иметь специальные устройства, разработанные специально для промывания узких отверстий пипеток.
5.15.2 Использование
Существует много типов машин для мытья стеклянной посуды, и обычно их устанавливают и эксплуатируют в соответствии с инструкцией изготовителя.
5.15.3 Проверка
Эффективность мытья оценивают посредством визуального осмотра, а в критических случаях проводят испытания, чтобы убедиться, что вымытая стеклянная посуда не содержит веществ, ингибирующих рост микроорганизмов.
Наличие щелочных и кислых остатков проверяют посредством использования индикаторного раствора. Необходимо, чтобы рН оставался в пределах диапазона 6,5-7,3.
5.15.4 Обслуживание
Регулярное обслуживание осуществляют в соответствии с рекомендациями изготовителя с установленным графиком.
Более частое обслуживание может потребоваться при интенсивном использовании машины для мытья стеклянной посуды в регионах с повышенной жесткостью воды.
5.16 Оптический микроскоп
5.16.1 Описание
Существует несколько различных типов микроскопа: монокулярный, бинокулярный, с дисплеем, с камерой или оборудованием для флюоресценции и т.д., и с внутренним и наружным источником света. Для бактериологических экспертиз используют объективы с увеличением от 10 (сухая линза) до примерно 100x (объектив с масляной иммерсией и подпружинной турелью) для получения общего увеличения от 100x до 1000x. Фазово-контрастная микроскопия также является необходимым атрибутом исследований "мокрых препаратов".
5.16.2 Использование
Оптику микроскопа устанавливают в соответствии с инструкцией изготовителя. Оптическая ось света от лампы высокой интенсивности должна проходить через центр конденсора микроскопа, колено окуляра и линзу объектива в окуляр так, чтобы не возникали сферические и хроматические аберрации.
5.16.3 Обслуживание
Необходимо следовать инструкции изготовителя в отношении хранения, очистки и обслуживания. Необходимо предотвращать появление конденсата, возникающего при высокой влажности, так как это приводит к ухудшению качества линз.
После каждого исследования удаляют иммерсионное масло с линз и прилегающих частей, используя ткань для протирки линзы. Можно использовать растворитель, рекомендованный изготовителем. Регулярно удаляют жир с поверхности окуляра, вызванный прикосновением ресниц.
Оптические системы могут легко повреждаться, и поэтому желательно, чтобы они обслуживались изготовителем.
5.17 Газовая горелка и прокаливатель проволоки
5.17.1 Описание
Газовые горелки (Бунзена) производят узкое открытое пламя и работают или от магистрального газа, или газа из баллона. Степень нагревания горелки варьируют с помощью изменения количества воздуха, смешиваемого с газом.
Газовые или электрические прокаливатели проволоки достигают температуры красного каления без образования пламени и используются для стерилизации бактериологических петель и непосредственно проволоки, используемой для работы с микробиологическими культурами.
5.17.2 Использование
Газовую горелку используют для стерилизации металлических петель и прямых проволок, доводимых до температуры красного каления, и для стерилизации пламенем других мелких прочных изделий и оборудования для микробиологической работы.
Прокаливатели используют для стерилизации металлических петель и прямых проволок при работе с патогенными бактериями, поскольку они предотвращают разбрызгивание материала и позволяют избежать риска перекрестного заражения.
Газовые горелки могут производить много тепла и создавать турбулентность воздуха в лаборатории.
Работу в стерильных условиях можно осуществлять без газовой горелки при использовании одноразовых материалов.
В боксах биологической безопасности следует отказаться от использования газовых горелок, потому что пламя газовых горелок будет смешиваться с ламинарным потоком воздуха и нарушать его течение. В этом случае рекомендуется использование стерильного одноразового инструментария.
5.17.3 Обслуживание
Регулярно чистят и обеззараживают горелки и крышки прокаливателей, особенно в случае проливания или попадания брызг какой-либо микробной культуры на приборы.
5.18 Дозатор (устройство для разливки) питательных сред и реактивов
5.18.1 Описание
Дозатор - это инструмент или устройство, используемое для дозированной разливки питательных сред и реактивов в пробирки, флаконы или чашки Петри. Такие приборы включают средства от простых мерных цилиндров, пипеток или ручных шприцев, автоматических шприцев и перистальтических насосов до электронных приборов, программируемых электронными устройствами с различными автоматическими настройками дозирования.
5.18.2 Использование
Чистое оборудование, используемое для дозированной разливки питательных сред и реактивов, должно быть свободно от ингибирующих веществ, подавляющих рост микроорганизмов. Необходимо использовать отдельные пробирки для селективных сред, чтобы минимизировать выщелачивание/перенос таких веществ.
Если требуется разливка стерильных питательных сред, все части дозатора, контактирующие со средами, должны быть стерильными.
5.18.3 Проверка
Погрешность измерения дозатора должна соответствовать максимально допустимой погрешности при дозировании объема, который необходимо разлить, и не должна превышать ±5 %. Максимальная допустимая погрешность измерения объема разлитой жидкости, используемой для приготовления десятичных разведений, - ±2 %.
Дозированные объемы жидкостей проверяют до первого применения, а затем регулярно в соответствии с зарегистрированным графиком и всегда после любых наладочных операций, которые могут влиять на дозирование объема.
5.18.4 Очистка и Обслуживание
Наружную поверхность дозатора очищают после каждого использования. Тщательно моют и ополаскивают все части дозатора, которые входят в контакт с продуктом, и, если требуется для разливки стерильной жидкости, стерилизуют их. Не допускается использовать дезинфицирующие средства, входящие в контакт с продуктом, который будет разливаться, так как они могут обладать ингибирующими свойствами.
Все автоматические дозаторы должны содержаться в хорошем состоянии посредством постоянного обслуживания в соответствии с инструкциями изготовителя.
5.19 Вихревой механический смеситель (Вортекс)
5.19.1 Описание
Этот прибор облегчает гомогенизирующее смешивание жидких сред (например, десятикратных разведений и образцов жидкости для исследований) или суспензий бактериальных клеток в жидкости.
Перемешивание достигается с помощью эксцентричного движения содержимого пробирки или контейнера (создаваемого водоворотом).
5.19.2 Использование
Прижимают основание пробирки или контейнера, содержащих жидкость, которую надо перемешать, к дну смесителя. Скорость перемешивания регулируется с помощью изменения оборотов двигателя или угла контакта с дном смесителя.
Оператор должен следить за тем, чтобы в течение перемешивания не произошло разбрызгивания. Это осуществляется посредством регулирования скорости и удерживания пробирки приблизительно на одной трети ее длины от верхнего края, чтобы лучше контролировать положение пробирки и, следовательно, избежать слишком высокого подъема жидкости в пробирке.
Необходимо предпринять соответствующие меры предосторожности, чтобы свести к минимуму выброс аэрозолей при открывании контейнеров после перемешивания.
5.19.3 Проверка
Об адекватном перемешивании свидетельствует появление воронки по всей глубине жидкости в процессе перемешивания.
5.19.4 Обслуживание
Смеситель содержат в чистоте. Если происходит разбрызгивание, прибор обеззараживают, используя применяемое в лаборатории дезинфицирующее средство.
5.20 Устройство для подсчета колоний
5.20.1 Описание
Ручные устройства подсчета колонии используют счетное устройство, приводимое в действие под давлением и обычно дающее звуковой сигнал каждой единицы счета и цифровую индикацию общего количества колоний. Они могут быть простыми устройствами, похожими на авторучку, или могут состоять из освещенного столика с калиброванной сеткой для помещения чашки и увеличительного экрана для облегчения подсчета колоний. Автоматические электронные счетчики колоний, включающие анализаторы изображения, работают в комбинации с аппаратными средствами ЭВМ и системами программного обеспечения; используют также видеокамеры и монитор.
5.20.2 Использование
Необходимо выполнять инструкции изготовителя. Регулируют чувствительность автоматического счетчика, чтобы обеспечить подсчет всех подлежащих подсчету колоний. Автоматические электронные счетчики колоний требуют отдельного программирования, если их применяют с различными типами питательных сред и матриц, и обеспечивают подсчет колоний на поверхности агара или внутри питательной среды.
5.20.3 Проверка
Необходимо осуществлять регулярно проверку подсчета вручную, чтобы гарантировать точность подсчета, выполненного счетчиком колоний.
Для этого автоматические счетчики колоний следует проверять каждый день с калибровочной чашкой, содержащей известное число подсчитываемых частиц или колоний для подсчета.
5.20.4 Обслуживание
Оборудование необходимо содержать в чистоте, свободным от пыли; избегать повреждения поверхностей, которые являются существенным элементом процесса подсчета. Осуществляют плановое регулярное обслуживание электронных счетчиков, включающих анализаторы изображения в соответствии с инструкциями изготовителя с подходящей частотой.
5.21 Оборудование для культивирования в измененной атмосфере
5.21.1 Описание
Это может быть сосуд, герметично запечатанный, или любое другое подходящее оборудование, которое способно поддерживать условия измененной атмосферы (например, анаэробиоз) в течение всего периода инкубации питательной среды. Допускается использовать другие системы с равноценными характеристиками типа анаэробных камер.
При установке и обслуживании следуют инструкциям изготовителя оборудования.
5.21.2 Использование
Состав требуемой атмосферы может быть достигнут посредством заполнения газовой смесью (например, из газового баллона) после вытеснения воздуха из сосуда, изменением атмосферы в шкафу или любыми другими подходящими средствами (например, газовые пакеты, имеющиеся в продаже).
Инкубация в анаэробных условиях требует атмосферы, содержащей менее чем 1% кислорода, от 9% до 13% двуокиси углерода; микроаэробное инкубирование требует атмосферы, содержащей 5%-7% кислорода и приблизительно 10% двуокиси углерода.
Условия могут требовать модификации в зависимости от потребностей конкретного микроорганизма.
5.21.3 Проверка
В каждую камеру при использовании помещают биологический или химический индикатор для контроля за качеством атмосферы. Рост контрольного штамма или изменение цвета химического индикатора свидетельствует, что соответствующие условия инкубации достигнуты.
5.21.4 Обслуживание
Если катализатор соответствует условиям исследования, его необходимо установить в соответствии с инструкциями изготовителя. Если имеется клапан, его необходимо чистить и смазывать, чтобы гарантировать надлежащее функционирование. Заменять его следует по мере необходимости.
Оборудование необходимо регулярно очищать и проводить санитарную обработку.
5.22 Центрифуга
5.22.1 Описание
Центрифуги - это механические устройства, в том числе управляемые с помощью электроники, которые используют центробежную силу для отделения взвешенных частиц, включая микроорганизмы, от жидкостей.
5.22.2 Использование
В некоторых случаях концентрация определяемых микроорганизмов достигается путем центрифугирования жидких проб, чтобы получить осадок, который можно снова суспендировать в жидкости и подвергнуть дальнейшему исследованию.
Необходимо принять все меры предосторожности, чтобы предотвратить возникновение аэрозоля и перекрестное заражение. С этой целью необходимо использовать закрытые и стерильные центрифужные пробирки или другие специальные сосуды.
5.22.3 Проверка
Когда скорость центрифугирования максимальная, как указано в инструкции по применению, индикатор скорости или установочные параметры следует регулярно проверять по калиброванному независимому тахометру, а также после существенного ремонта или модификаций.
5.22.4 Обслуживание
Центрифуги регулярно очищают и обеззараживают. После проливания материала с микроорганизмами или потенциально зараженных проб центрифуги дополнительно очищают и обеззараживают.
Необходимо постоянное обслуживание центрифуг.
5.23 Нагревательная плитка и кожух с нагревом
5.23.1 Описание
Нагревательные плитки и кожухи представляют собой нагревательные устройства с термостатическим контролем. Некоторые нагревательные плитки и кожухи имеют активные системы магнитных мешалок.
5.23.2 Использование
Нагревательные плитки и кожухи с нагревом, оборудованные системами магнитных мешалок, используют для нагревания относительно больших объемов жидкостей, таких как питательные среды.
Нельзя использовать нагревательные плитки и кожухи без систем перемешивания при приготовлении питательных сред.
5.23.3 Обслуживание
Все брызги и пролитый материал сразу удаляют, как только остынет нагревательный прибор.
5.24 Дозатор для нанесения посевного материала на поверхность сред по спирали (спиральный дозатор)
5.24.1 Описание
Спиральный дозатор - это аппарат, который распределяет предварительно установленный объем жидкости по поверхности вращающихся чашек с агаром. Дозирующая игла движется от центра чашки к наружному ее краю по траектории, называемой спиралью Архимеда. Распределяемый объем уменьшается по мере движения иглы от центра к краю чашки таким образом, чтобы существовала обратно пропорциональная зависимость между выливаемым объемом и радиусом спирали. Объем пробы, распределенной на любой конкретный сегмент, известен и постоянен. Требуется источник вакуума для загрузки и разливки жидкостей.
5.24.2 Использование
Прибор применяют для разливки жидкого образца, гомогенного образца или разведения на соответствующей агаровой чашке для подсчета колоний. После инкубации колонии распределяются по линиям, по которым была распределена жидкость. Подсчитывают число колоний на определенной площади, используя специальную (координатную) сетку для подсчета, поставляемую с оборудованием, и определяют количество колоний.
Поверхность агаровых чашек, которые используют со спиральным дозатором, должна быть ровной и без воздушных пузырей.
Чашки должны быть подсушены перед использованием, чтобы удалить избыток влаги.
Дозирующая система должна проходить санитарную обработку и ополаскиваться стерильной водой перед разливкой каждого образца и после окончания работы.
5.24.3 Проверка
Проверяют ежедневно угол наклона конца дозирующей иглы, используя вакуум для удерживания покровного стекла относительно передней части иглы. Покровное стекло должно быть параллельно поверхности агара и расположено от нее на расстоянии 1 мм.
Рисунок распределения образца следует проверить с помощью смываемых чернил. Рисунок распределения образца должен быть наиболее плотным около центра пластины, где начинается разливка образца, и становиться менее плотным в точке подъема кончика иглы дозатора. Чистая часть чашки должна быть в центре и иметь диаметр около 2,0 см.
Следует выполнять ежедневную проверку, чтобы обеспечить расположение наконечника дозирующей иглы под правильным углом к поверхности агара, используя покровное стекло и шаблон уровня, поставляемый вместе с прибором.
Стерильность спирального дозатора следует проверять с помощью стерильной воды для каждой партии исследуемых образцов.
Гравиметрическую проверку распределяемого объема необходимо выполнять регулярно с помощью дистиллированной воды. Полученная масса должна быть в пределах максимально допустимой ошибки ±5 % от ожидаемой массы для распределенного объема.
5.24.4 Обслуживание
Дезинфекция трубок дозатора и дозирующей иглы может быть достигнута промыванием раствором, содержащим от 0,5% до 1% свободного хлора. Затем прибор следует промыть стерильной или деионизированной водой.
Засорение дозатора и дозирующей иглы можно предотвратить, не допуская попадания частиц перед загрузкой суспензии образца, отбирая его из надосадочной жидкости.
Пролитый материал необходимо немедленно удалить, а дозатор очищать регулярно.
Дозатор необходимо обслуживать и проверять в зависимости от интенсивности использования.
5.25 Дистилляторы, деионизаторы и установки обратного осмоса
5.25.1 Описание
Эти устройства применяют для получения дистиллированной или деионизированной/деминерализованной воды требуемого качества (см. ISO/TS 11133) для получения микробиологических питательных сред или реактивов и для других работ в лаборатории.
5.25.2 Использование
Устанавливают, проверяют и используют оборудование в соответствии с инструкциями изготовителя, принимая во внимание местоположение подачи воды в лаборатории, электрическое питание и стоки для отходов.
5.25.3 Проверка
Качество воды следует проверять регулярно, особенно когда используют оборудования после хранения, на электропроводность, которая должна быть не более 25 мкСм/см (эквивалентно удельному сопротивлению 40000 Ом·см) для приготовления реактивов и питательных сред.
После хранения воды или пропускания ее через ионообменник перед использованием воду проверяют на микробное загрязнение в соответствии с ISO/TS 11133.
5.25.4 Обслуживание
Дистилляторы необходимо промывать и освобождать от накипи с частотой, которая зависит от жесткости пропускаемой через них воды.
Деионизаторы и дистилляторы обслуживают в соответствии с инструкциями изготовителя.
5.26 Таймеры и счетчики времени
5.26.1 Описание
Таймеры и интегральные счетчики времени - это приборы, которые используют в лаборатории для определения продолжительности времени, или время является определяющим параметром.
5.26.2 Использование
Аналоговый и цифровой карманный компьютеры или настольные таймеры используют для контроля продолжительности лабораторных операций (например, окрашивания микробных мазков, гомогенизации образцов), и они должны содержаться в хорошем рабочем состоянии и обеспечивать необходимую точность.
С встроенными интегральными таймерами на лабораторном оборудовании (например, на автоклавах, центрифугах, гомогенизаторах) необходимо обращаться в соответствии с инструкциями изготовителя. Эти таймеры должны обеспечивать требуемую точность.
5.26.3 Проверка
Регулярно и после ремонта осуществляют проверку таймеров, используемых в лабораторных операциях, продолжительность которых является решающим параметром для получения результата. Проверку осуществляют по сигналам службы точного времени.
5.26.4 Обслуживание
Регулярно чистят и проверяют таймеры на надлежащее функционирование.
Интегральные счетчики времени следует проверять в рамках технического обслуживания прибора.
5.27 Пипетки и пипеточные дозаторы
5.27.1 Описание
Пипетки стеклянные или одноразовые пластмассовые представляют собой устройства, используемые для переноса объемов жидких или вязких материалов. С помощью градуированных пипеток измеряют и переносят измеренные объемы жидких или вязких материалов с точностью, зависящей от требований.
Автоматические (механические) пипеточные дозаторы оснащаются пластмассовыми наконечниками - устройствами, которые забирают установленные или регулируемые объемы жидкостей под действием поршня с ручным или электрическим приводом.
5.27.2 Использование
Не допускается использование поврежденных или разбитых (бракованных) пипеток.
Стерильные пастеровские или мерные пипетки и наконечники пипеточного дозатора должны быть заткнуты неабсорбирующим ватным тампоном, чтобы предотвратить заражение, когда проводится работа с микробными культурами.
Нельзя проводить пипетирование ртом при работе с микроорганизмами, за исключением работы с неконтаминированными жидкостями.
Резиновые груши, используемые на пастеровских или градуированных пипетках, и наконечники для пипеточных дозаторов должны иметь правильный размер, чтобы предотвратить протекание и обеспечить эффективную работу.
5.27.3 Проверка
Мерные пипетки проверяют, чтобы подтвердить перенос требуемого объема, если изготовитель не сертифицирует их точность (правильность и прецизионность).
Калибровка пипеток/дозаторов описана в ISO 835 (все части) и ISO 8655-1.
Перед использованием новые пипеточные дозаторы проверяют. Проверку проводят через регулярные интервалы времени в зависимости от частоты и характера использования. Проверкой подтверждают, что приборы соответствуют максимально допустимой погрешности, определенной в соответствии ISO 8655-1. Выполняют промежуточные гравиметрические проверки, используя дистиллированную или деионизированную воду для того, чтобы переносимые объемы оставались в рамках максимально допустимых ошибок.
Проверяют все новые партии мерных пипеток.
5.27.4 Обслуживание
Дезактивируют, моют и стерилизуют все пипетки многоразового пользования и автоматические пипеточные дозаторы после каждого использования.
Если цилиндры или поршни автоматических пипеточных дозаторов стали загрязненными при использовании, их демонтируют для дезактивации и очистки. После повторной сборки их повторно калибруют. Если это невозможно сделать в лаборатории, пипеточные дозаторы возвращают изготовителю для повторной сборки и повторной калибровки.
5.28 Термометры и температурно-контролирующие устройства, включая автоматические записывающие устройства
5.28.1 Описание
Термометры бывают стеклянными ртутными или стеклянными спиртовыми и используются для измерения температуры в диапазоне лабораторной деятельности.
Другие устройства контроля температуры включают платиновые термометры сопротивления и инструменты, которые имеют термоэлектроды для измерения температуры и обеспечивают визуальный контроль и запись на бумажном или электронном носителе изменения температуры во времени.
Контрольные термометры и другие устройства контроля температуры должны быть калиброваны в соответствии с международными стандартами и сертифицированы. Они должны использоваться только для контроля, а не для повседневной работы.
Рабочие термометры и другие устройства регистрации температуры должны быть калиброваны таким образом, чтобы позволять отслеживать колебания температуры в соответствии с национальными и международными стандартами.
Могут быть использованы устройства адекватной точности, которые соответствуют международному стандарту в качестве рабочих термометров после проверки их работы.
5.28.2 Использование
Термометры и другие устройства контроля температуры должны обеспечивать измерение температуры, требуемое методикой в установленных пределах с максимально допустимой погрешностью.
Неопределенность измерения для мониторинга температуры должна быть в четыре раза меньше, чем диапазон максимально допустимой погрешности. Например, для заданной максимально допустимой погрешности ±1°С погрешность измерения должна быть ±0,25°С; для заданной максимально допустимой погрешности ±0,5°С погрешность измерения должна быть ±0,125°С. Неопределенность измерения калибровки контрольного термометра необходимо также принимать в расчет при определении рабочей температуры.
В целях обеспечения достоверных показаний термометры или термоэлементы, помещенные в воздушные термостаты, должны быть в контейнерах, заполненных глицерином, жидким парафином или полипропиленгликолем, являющимися буфером, предохраняющем от влияния тепла, которое возникает при открывании дверцы.
При использовании термометров полного погружения полностью погружают только шарик термометра.
Термометры, помещенные в водяные бани, должны быть погружены в воду в соответствии с индивидуальными техническими требованиями, например, термометры частичного погружения необходимо погрузить на глубину, указанную для данного термометра, например 76 или 100 мм.
Ртутные термометры в стекле хрупкие, и, если есть риск разбития, они должны быть помещены внутри защитных устройств, которые не соприкасаются с термометрами, измеряющими температуру.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Ртуть опасна для здоровья. Разбитые термометры удаляют в соответствии с инструкциями.
5.28.3 Проверка
Контрольные термометры должны быть калиброваны по всему диапазону отслеживаемых стандартов перед начальным использованием и затем не реже одного раза каждые 5 лет. Промежуточную калибровку по одной точке (например, температуру таяния льда) следует выполнять для проверки точности работы термометра.
Контрольные термопары должны быть полностью калиброваны по прослеживаемым стандартам перед начальным использованием в соответствии с инструкцией изготовителя. Промежуточные проверки следует проводить по показаниям контрольного термометра для проверки точности работы прибора.
Другие устройства контроля температуры (такие как приемники радиоволн) должны быть калиброваны по прослеживаемым стандартам в соответствии с инструкциями изготовителя.
Рабочие термометры и термоэлементы должны быть проверены при температуре таяния льда и/или по контрольному термометру в диапазоне рабочих температур.
5.28.4 Обслуживание
Термометры и термоэлементы необходимо содержать в чистоте и рабочем состоянии.
Другие средства контроля температуры необходимо поддерживать в соответствии с инструкциями изготовителя.
5.29 Иммуномагнитный сепаратор
5.29.1 Описание
Это оборудование применяют, чтобы отделить и сконцентрировать исследуемые микроорганизмы в жидких культурах посредством парамагнитных бусинок, покрытых соответствующими антителами.
Ручные сепараторы состоят из ротационного миксера, способного создавать скорость от 12 до 20 об/мин, и концентратора частиц со сменным полосовым магнитом.
Автоматические сепараторы используют устройства, подобные гребенке с множеством магнитных стержней в виде гребней и штативов с пробирками. Магнитные частицы перемещаются от пробирки к пробирке и осуществляют полную процедуру разделения, включая стадии отмывок, выполняемых автоматически.
5.29.2 Использование и проверка
При использовании руководствуются инструкцией изготовителя и теми инструкциями, которые приведены в конкретных стандартах (например, для E.coli O1157).
В ручных системах проверяют скорость вращения миксера.
В ручных и автоматизированных системах перед использованием проверяют, чтобы система обладала способностью изолировать низкое количество интересующего микроорганизма.
Во время процедуры ручного разделения не допускается перекрестное заражение.
5.29.3 Обслуживание
Оборудование осматривают и поддерживают в соответствии с инструкциями изготовителя.
5.30 Система фильтрации
Используемая система фильтрации должна соответствовать описанной в ISO 8199.
5.31 Другое оборудование и программное обеспечение
Другое оборудование и связанное с ним программное обеспечение должны обеспечивать требуемую точность и выполнение спецификаций, необходимых для проводимых испытаний. Программы калибровки следует разрабатывать для ключевых показателей качества или уровней там, где эти свойства оказывают существенное влияние на результат. Перед повседневной работой калибруют или проверяют оборудование, чтобы подтвердить его соответствие требованиям лаборатории и техническим условиям для выполнения необходимых стандартных операций. Любые изменения конфигурации или модификации программ, проведенные в лаборатории, должны быть проверены, чтобы гарантировать, что измененное программное обеспечение дает надежный и правильный результат.
2. Биологический фактор | ||
2.1. Нормативные документы | ||
2.1.1 | ГН 2.2.6.709-98 | Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны |
2.1.2 | ГН 2.2.6.1006-00 Дополнение N 1 к ГН 2.2.6.709-98 |
Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны |
2.1.3 | ГН 2.2.6.1080-01 Дополнение N 2 к ГН 2.2.6.709-98 |
Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны |
2.1.4 | ГН 2.2.6.1762-03 Дополнение N 3 к ГН 2.2.6.709-98 |
Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в воздухе рабочей зоны |
2.2. Методические документы | ||
2.2.1 | прилож.9 | Требования к контролю содержания микроорганизмов в воздухе рабочей зоны |
2.2.2 | МУ 4.2.734-99 | Микробиологический мониторинг производственной среды |
2.2.3 | МУК 4.2.1007-00 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента Биовита и хлортетерациклина Streptomyces aurefaciens 777 в воздухе рабочей зоны |
2.2.4 | МУК 4.2.1008-00 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) B99 - продуцента витамина В в воздухе рабочей зоны |
2.2.5 | МУК 4.2.1067-01 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина в воздухе рабочей зоны |
2.2.6 | МУК 4.2.1068-01 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны |
2.2.7 | МУК 4.2.1069-01 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium funiculosum F-149 - продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны |
2.2.8 | МУК 4.2.1070-01 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцента -глюканазы в воздухе рабочей зоны |
2.2.9 | МУК 4.2.1071-01 | Метод микробиологического измерения концентрации препарата ЭМ-1 "Байкал" по одному из ведущих компонентов (Lactobacillus casei - 21) в воздухе рабочей зоны |
2.2.10 | МУК 4.2.1072-01 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium vermiculatum PК-1 - продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны |
2.2.11 | МУК 4.2.1776-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента глюкоамилазы Aspergillus awamori 120/177 в воздухе рабочей зоны |
2.2.12 | МУК 4.2.1777-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента ловастатина Aspergillus terreus 44-62 в воздухе рабочей зоны |
2.2.13 | МУК 4.2.1778-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента нейтральной протеиназы и амилазы Bacillus subtilis 65 в воздухе рабочей зоны |
2.2.14 | МУК 4.2.1779-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента щелочной протеазы Bacillus subtilis 72 в воздухе рабочей зоны |
2.2.15 | МУК 4.2.1780-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента нейтральной протеазы Bacillus subtilis 103 в воздухе рабочей зоны |
2.2.16 | МУК 4.2.1781-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента бацитрацина Bacillus licheniformis 1001 в воздухе рабочей зоны |
2.2.17 | МУК 4.2.1782-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента ксилита Candida tropicalis Y456 в воздухе рабочей зоны |
2.2.18 | МУК 4.2.1783-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента ксиланазы Penicillium canescens F-832 в воздухе рабочей зоны |
2.2.19 | МУК 4.2.1784-03 | Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента комплекса целлюлолитических ферментов Trichoderma viride 44-11-62/3 в воздухе рабочей зоны |
МУК 4.2.1054-01
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
3.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест.
Дата введения 2001-10-01
1. ПОДГОТОВЛЕНЫ: д.м.н. М.В.Далин (Российский Университет дружбы народов), к.м.н. Н.П.Сергеюк (Научно-исследовательский центр "ЭКОС") на основании материалов секции "Гигиенические аспекты биотехнологии микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной Комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды"
2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по госсанэпиднормированию Минздрава России (прот. N 7 от 28.04.01)
3. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 июня 2001 г.
4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентраций промышленных микроорганизмов и бактериальных препаратов в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне от 100 до 5000 клеток в 1 м3воздуха.
Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля концентрации промышленных микроорганизмов и бактериальных препаратов в атмосферном воздухе населенных мест и оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и 8.653-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма микроорганизма
2.1. Таксономическое положение штамма
2.2. Морфология колоний и клеток. (Данные по каждому штамму для п.п.2.1, 2.2 представлены в табл.)
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздушной среде в диапазоне концентраций от 10 до 5000 клеток в 1 м 3воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
5. Средства измерений, оборудование, вспомогательные устройства, материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) | ТУ 64-12791-77 |
Импактор микробиологический ИМБ-15 | |
Прибор для бактериологического анализа воздуха "Флора-100" | |
Термостаты электрические суховоздушные или водяные | |
Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами | |
Холодильник бытовой | |
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 | |
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 | |
Лупа с увеличением 10х | ГОСТ 25706-83 |
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм | |
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл | ГОСТ 10515-75 |
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл | ГОСТ 10515-75 |
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл | ГОСТ 1770-74 |
Секундомер | ГОСТ 9586-75 |
Барометр | ГОСТ 24696-79 |
Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 25556-81 |
5.2. Питательные среды
Агар микробиологический | ГОСТ 17206-96 |
Селективная среда (среда для каждого штамма микроорганизмов представлена в табл.). |
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток в воздушной среде соблюдают следующие требования.
Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.
Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Проведение измерения
8.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации микроорганизма производят отбор проб воздуха при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время отбора пробы воздуха 20 мин. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. В том случае, если определяется концентрация микроорганизмов, имеющих обильный воздушный мицелий, отбор производят в жидкостные поглотители с последующим разведением и посевом на плотную питательную среду.
8.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3-4 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний.
Селективную среду тщательно перемешивают и разливают по 20 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. При необходимости в селективную среду добавляют компоненты, подавляющие рост посторонней микрофлоры. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37°С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри инкубируют в термостате и производят подсчет выросших типичных колоний. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
9. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток в перерасчете на 1 м3воздуха производят по формуле:
X=(N*1000)/V, кл/м3, где
X - концентрация клеток в воздухе;
N - количество колоний, выросших на чашке;
1000 - коэффициент перерасчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
Для консорциумов микроорганизмов используют следующую методику подсчета:
A=100*N/d, где
A - концентрация консорциума (КОЕ/м3)
N - концентрация контрольного микроорганизма (КОЕ/м3)
d - содержание контрольного микроорганизма в консорциуме (%).
Контрольные микроорганизмы, входящие в состав консорциумов (препаратов, созданных на основе живых микроорганизмов и включающих в себя два и более штаммов), представлены в табл. с пометкой КМ, там же приведены торговые названия препаратов.
Используемые сокращения и условные обозначения
АС - Агаризованная среда
МПА - Мясо-пептонный агар
МСЭА - Агар с экстрактом мозга и сердца
РНСП - Роды с неясным систематическим положением
САС - Синтетическая агаризованная среда
ВЗ - Выброс запрещен
Пояснение к таблице
Микроорганизмы, сведения о которых представлены в табл., разделены на группы, не являющиеся формальными таксономическими категориями, но подразделяющие штаммы на легко определяемые фенотипические единицы.
Таксономическое положение каждого штамма определено до уровня семейства за исключением т.н. "Родов с неясным систематическим положением" согласно "Определителю бактерий Берджи" (М., "Мир", 1997).
Для каждого из штаммов микроорганизмов представлена селективная твердая питательная среда и специальные добавки в среду, необходимые для подавления посторонней микрофлоры.
Колонка "Примечания" содержит сведения об особенностях штамма как упрощающих его идентификацию (способность к образованию какого-либо пигмента, специфическая ферментативная активность и т.д.), так и создающих возможность экспресс-диагностики.
Таблица
Идентификация микроорганизмов и условия их культивирования
N п/п | ПДКaтм., кл/м3 | Таксономическое положение | Питательная среда (базовая) | Добавки в питательную среду для подавления посторонней микрофлоры | Условия культивирования (время инкубации и t,°C) |
Морфологические признаки колоний | Примечания |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
Грамотрицательные аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки | |||||||
1 | 50 | Семейство: Neisseriaceae. Род: Аcinetobacter Вид: oleovorum s/paraffinicum шт. ВСБ 712 |
МПА | Спирт этиловый рект. 2 мл/100 мл среды | 1 сутки 38°C |
Круглые с ровным краем, блестящие, бесцветные, d - 3-4 мм | |
2 | 300 | Вид species шт. ВСБ 644 |
МПА | Спирт этиловый рект. 2 мл/100 мл среды | 3 суток 37°C |
Округлые, гладкие, слабо выпуклые, с ровным краем, светлые, d - З мм | |
3 | 500 | Семейство: Azotobacteriaceae Род: Azotobacter Вид: Vinelandii (Lipman) шт. Ф.ч-1 |
Мясная вода/МПА-1/1, пептон 10,0, натрий хлористый 5,0, глюкоза 10,0, агар 2,0, рН 7,2-7,4 | Амфотерицин 10 мкг/мл, стрептомицина сульфат 250 мкг/мл |
2-3 суток 28°C | Мелкие, выпуклые, плотные, маслянисто- блестящие, вросшие в агар | Синтезирует водорастворимый пигмент, флуоресцирующий в УФ-лучах |
4 | 200 | Семейство: Pseudomonaceae Род: Pseudomonas Вид: fluorescens шт. К3б |
МПА | Нафталин 2 мл/100 мл среды |
2 суток 28°C |
Полупрозрачные, глянцевые, слегка опалесцирующие, в центре небольшое уплотнение в виде точки, d - 1,4-2,2 |
При добавлении нафталина - темно-коричневая окраска |
5 | 2000 | шт. ST | МПА | Фенол, ацетон, стирол (2 мл/100 мл среды) | 2 суток 28°C |
Глянцевые, опалесцирующие d - 2 мм |
|
6 | 30 | Вид: stutzeri шт. 367-1 |
Картофельный агар | Низкомолекулярные спирты (кроме метанола) 2 мл/100 мл среды |
2 суток 32°C |
Светло-серые, круглые, в центральной части угристые, бежевые, край волнистый прозрачный | КМ, препарат "Деваройл" |
7 | 1000 | РНСП Род: Acetobacter Вид: methylicum шт. ВСБ-924 |
САС с метанолом |
Метанол 2 мл/100 мл среды (pН 4,5) |
3 суток 30-35°C | Выпуклые, гладкие, серовато-белые, слизистой консистенции | |
Грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры | |||||||
8 | 200 | Семейство: Bacillaceae Род: Bacillus Вид: polymixa шт.- |
Различные агаризованные среды (белково- витаминный агар, кукурузо- пептонный агар) | Амфотерицин В (10 мкг/1 мл среды) либо Полимиксин М |
1 сутки 30-37°C | Круглые, в центре выпуклые, шероховатые, с лопастным краем, желтовато- сероватого цвета, d - 2-2,5 мм | |
9 | 200 | шт. F-12 | |||||
10 | 1000 | Bид: Subtilis шт. 265-76 |
|||||
Грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы | |||||||
11 | 2000 | Семейство: Lactobacillaceae Род: Lactobacillus Вид: cazei шт. 21 |
Среда Рогози МПА | Желчь | 7-8 суток 30°C | Мелкие, круглые колонии. Глубинные колонии с выростими | КМ препарата "Байкал" |
Факультативные анаэробные грамотрицательные палочки | |||||||
12 | ВЗ | Семейство: Enterobacteriaceae Род: Esherihia Вид: соli. шт. 1864 |
Среда Эндо | Ампициллин 200 мкг/1 мл среды |
1 сутки 27°C |
Выпуклые, с блестящей поверхностью, ровными краями, легко эмульгирующие в солевом растворе, не пигментированные | ГИЖ |
13 | ВЗ | шт. 472-Т23 | |||||
14 | ВЗ | шт. ТДГ-6 | |||||
15 | ВЗ | шт. 436 | |||||
Актиномицеты и родственные микроорганизмы. Группа коринеформных бактерий | |||||||
Грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы | |||||||
16 | 100 | Семейство: Actinomycetaceae Род: Actinomyces Вид: rozeolus шт. Z-219 |
Кровяной агар МСЭА, среда Гаррода | 7-14 суток | "Паукообразная" колония с многочисленными ветвящимися нитями | Отбор в жидкостный поглотитель | |
17 | 3000 | Семейство: Corynebacteriaceae Pод: Corynebacterium Вид: glutamicum шт. ВКПМ-B5115 |
МПА | Грамицидин 10 мкг/мл среды |
3 суток 32°C |
Желтоватого цвета с ровным краем, d не более 5 мм | |
18 | 1000 | шт. ВСБ206-L | МПА | Грамицидин 50 мкг/мл | 3 суток 32°C |
Желтоватые или желтые с ровным краем, d - 5мм | |
19 | 5000 | Семейство: Brevibacteriaceae Род: Brevibacterium Вид: flavum шт. ВНИИ Генетика 50-72(ВКПМ-B37-57) |
Агар Хоттингера | 3 суток 32°С |
Серовато-белые или кремовые, круглые, выпуклые, с ровным краем, влажно блестящие, d - Змм | Для роста нуждаются в тиамине | |
20 | ВЗ | Вид: lactofermentum шт. НИТИА-89 | Агар Хоттингера | 3 суток 29-31°C | Твердые, крупные, кремового цвета | ||
Нокардиоформные актиномицеты | |||||||
21 | 200 | Семейство: Nocardiaceae Род: Nocardia Вид: mediterranii |
САС (Красильникова, Гаузе1) и органические АС | Амфотерицин В 5 мкг/мл |
8-12 суток 28°C | Крупные, чашевидные или плоские складчатые, крошащиеся. Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент на разных средах от зеленовато-бурого до ржавого или красновато- коричневого | Ускоренный метод основан на способности выделять рифамицин, который образует зоны задержки роста тест-культуры (St. Aureus 209 3) |
22 | 5000 | РНСП Род: Rhodoсoсcus Вид: eritropolis шт. 367-2, 367-6 |
АС Раймонда | Нефть или нефтепродукты 2 мл/100 мл среды |
4 суток 30-32°C |
Оранжевые или ярко-оранжевые, круглые, выпуклые с ровным краем, блестящие | КМ препарата "Деваройл" |
23 | 5000 | Вид: maris шт. 367-5 | Картофельный агар | Нефть или нефтепродукты 2 мл/100 мл среды |
4 суток 30-32°C |
Ярко-оранжевые, круглые, выпуклые с ровным краем, блестящие | КМ препарата "Деваройл" |
24 | 5000 | Вид: ruber шт.1418 (ВКМ Ас 1513 D)33 | Картофельный агар | 4 суток 30°C |
Красные, круглые, выпуклые, слизистые | ||
Актинопланы | |||||||
25 | 25 | Семейство: Micromonosporaceae Род: Micromonospora Вид: atratavinosa Sp. Nov. 1573 шт. 184 R |
САС Гаузе1 | Амфотерицин В 20 мкг/1 мл среды сизомицин 2000 мкг/мл среды |
10-12 суток 37°C |
Черные, выпуклые, со складчатой поверхностью, d - 3-5 мм, воздушного мицелия не образуют |
Черный или темно- коричневый пигмент |
26 | 500 | Вид: purpurea Var Violaceae | САС Гаузе1 | Амфотерицин В 10 мкг/мл среды |
10 суток 35°С | Поднимаются круто от поверхности среды, хорошо развит септированный мицелий | Розовый или розоватый пигмент |
Стрептомицеты и близкие к ним роды | |||||||
27 | 500 | Семейство: Streptomycetaceae Род: Streptomyces Вид: aureofaciens шт. 0,19 (8) |
Среда Хоттингера | Амфотерицин В 20 мкг/мл среды |
10-12 сут 28°C |
Обильный воздушный мицелий серого цвета. Колонии плоские, слабо складчатые, с кратером в центре | Отбор в жидкостный поглотитель |
28 | 500 | шт. STR 2255 | Округлые, выпуклые, серого цвета, с хорошо развитым воздушным мицелием, выделяют в среду темный пигмент | Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод - учет зон задержки роста тест-культуры Bac. Subtilis на агаре Хоттингера | |||
29 | 300 | Вид: cinnamonensis шт. НИЦБ 109 | ISP на основе агара Difco | Олеандомицин или линкомицин 15 мкг/мл среды |
3-4 сут 28°C |
Серо-белые, округлые, радиально- складчатые, с фестончатым краем и выпуклым более темным центром |
Отбор в жидкостный поглотитель |
30 | 300 | Вид: eritreus шт. 851 | Среда ЭР-1 | Эритромицина основание (фосфат) 250-500 мкг/мл среды | 10-14 сут 32°C |
Колонии с обильным воздушным мицелием, труднофрагмен- тируемым. Вегетативные гифы 0,5-2,0 мкм в диаметре |
Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на способности продуцировать антибиотик, который определяется по задержке зон роста тест-культуры (Bac. Subtilis 6633) |
31 | 500 | Вид: kanamyceticus | Среда Гаузе1 | Амфотерицин В 10 мкг/мл среды |
12 сут 28°C |
Округлые, плоские, d - 6 мм. Воздушный мицелий белый, обильный, субстратный - светло-коричневый | Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на способности продуцировать антибиотик, который определяется по задержке зон роста тест-культуры Bac. Subtilis ATCC 6633 (споры) |
32 | 500 | Вид: noursei шт.153/55 | Крахмально- аммиачная среда | Амфотерицин В 10 мкг/мл среды |
5 сут 27°C |
Белые с раздельной складчатостью, приподнятым центром, плоским волнистым краем. Воздушный мицелий серого цвета | Отбор в жидкостные поглотители |
33 | 300 | Вид: rimosus шт. 1-43 |
АС с кукурузным экстрактом и картофельным крахмалом | Амфотерицин В 20 мкг/мл среды |
8-12 сут 27°C |
Радиально складчатые, в центре - кратер, субстратный мицелий - коричневый, воздушный - светло-серый, хорошо развит |
Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на выделении в среду антибиотика и задержке зон роста тест-культуры (Bac. Subtilis вар. L2) |
34 | ВЗ | Род: Streptoverticillium Вид: griseocameum |
САС | Неомицин, лизоцим | 8 сут 25-30°C |
Небольшие обособленные, дымка воздушного мицелия бархатная или хлопьевидная, розовато-бежевого цвета с сиреневым оттенком | Отбор в жидкостные поглотители. Розовато- бежевый пигмент |
Микобактерии | |||||||
35 | 2000 | Семейство: Mycobacteriасeае Род: Mycobacterium Вид: species шт. В 3805 |
Кукурузно- мучной глицериновый агар | 7 сут 35-40°C | Воздушного мицелия не образует | Возможно образование пигмента | |
Грибы и дейтеромицеты | |||||||
36 | 500 | Род: Acrimonium Вид: chrizogenum шт. 298-А |
АС/обрат, 1/1 | Стрептомицин 500 мкг/мл среды |
9-11 суток 28°C | Выпуклые, правильно- складчатые, белого цвета, с зубчатыми краями |
Ускоренный метод основан на способности выделять протеазу, которую выявляют по образованию зон просветления среды вокруг колоний |
37 | 200 | Род: Candida Вид: Famata шт. ВСБ-641 |
Сусло-агар | Дрожжевой гидролизат. Стрептомицин 50 ЕД/1 мл среды |
2-3 суток 32-34°C | Однородные, гладкие, белые, с ровным краем | При посеве по трубочкам Эйнгорна с дрожжевой водой и глюкозой брожения нет |
38 | 20 | Вид: lipolitica шт. 367-3 | Картофельный агар, МПА, сусло-агар, минеральная среда Раймонда | Нефтепродукты 2 мл/100 мл среды |
2 суток 30-32°C | Беловатые, матовые, плоские, край волнистый, образует псевдомицелий | Отбор в жидкостные поглотители, КМ препарата "Деваройл" |
39 | 100 | Вид: tropicalis шт. ВСБ-928 |
Картофельный агар САС | З суток 30°C |
Круглые, беловатые, на 3-4 день псевдомицелий | Отбор в жидкостные поглотители | |
40 | 100 | Вид: Utilis шт. ВСБ-651 |
Картофельный агар, сусло-агар | 2 суток 30°C |
Белые, матовые, образует псевдомицелий | Отбор в жидкостные поглотители | |
41 | 500 | Род: Fuzidium Вид: coccineum шт. 108 |
Сусло-агар, среда N 9 (ГФ Х) | Амфотерицин В 10 мкг/мл среды | 9-14 суток 24°C | Круглые, складчатые, серовато-розовые с белым, слегка фестончатым краем, мицелий выражен слабо | Ускоренный метод основан на выделении фузидиевой кислоты, подавляющей рост тест-культуры (Вас, Мyсоides HB2) |
42 | 500 | Род: Penicilium Вид: chrisogenum |
Агаризованная среда Чапека, Райстрика | Канамицин 25-50 мкг/мл среды (неомицин, сизомицин) |
9-10 суток 24°C | Бежевые, складчатые, центр приподнят, края неровные, обратная сторона светло-коричневая | Ускоренный метод основан на выделении бензилпенициллина, подавляющего рост тест-культуры (St. Aureus 209 P) |
43 | 500 | Семейство: Entomophtorасеае Род: Entomophtorа | Сабуро- декстрозный агар | Карбенициллин 150 мкг/мл среды, амфотерицин - 10 мкг, полимиксин М 250 мкг |
4-5 суток 25°С | Округлые, складчатые, приподнятые к центру, серовато- кремового цвета |
|
44 | 200 | Род: Рichia Вид: membrana faciens |
Кукурузный агар | 3 суток 30-34°C | Кремовато-серого цвета, бархатистые, край лопастной, поверхность мучнистая, хорошо развитый ветвящийся псевдомицелий | Отбор в жидкостные поглотители | |
45 | 500 | Род: Trichoderma Вид: reesei шт. NIBT 18.2-33 |
Сусло-агар | Карбенициллин 150 мкг/мл среды | 4-5 суток 28-30°С | Круглые, с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, край волнистый, образует мицелий | Отбор в жидкостные поглотители. Выделяет ярко-желтый пигмент |
МУК 4.2.734-99
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ СРЕДЫ
Дата введения 1999-05-10
УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко, 1999 г.
1. Область применения
Данный документ предназначен в основном для производителей медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) и может служить в качестве руководства по методам общего микробиологического контроля в чистых помещениях, который включает в себя контроль воздуха рабочих зон, контроль поверхностей помещений и оборудования, контроль рук и одежды персонала.
Методические указания "Микробиологический мониторинг производственной среды" являются приложением к Санитарным правилам СП 3.3.2.015 "Производство и контроль медицинских иммунобиологических препаратов для обеспечения их качества. Good Manufacturing Practice", утвержденных постановлением Госкомсанэпиднадзора России от 12.08.94 г., N 8, а также продолжением соответствующих разделов Методических рекомендаций МУ-44-116 "Асептическое производство медицинских иммунобиологических препаратов", утвержденных МЗ России 19.05.97 г.
Микробиологический контроль воды, сжатого воздуха и других технологических газов, контроль механических частиц в данных методических указаниях не рассматриваются.
2. Общие положения
В данных методических указаниях рассматриваются ключевые факторы, которые необходимо учитывать при разработке и проведении программ микробиологического контроля производственной среды, составлении планов отбора проб, выборе методов и приборов для проведения исследований, установлении уровней тревоги и действия.
Приводимые в данном документе цифровые данные, методы отбора проб, приборы являются рекомендуемыми. Целесообразно их применение с учетом конкретных производственных условий и технологий.
Для достижения соответствующего микробиологического статуса производственной среды (см. Таблицу 1.3 Приложения 1 к Методическим рекомендациям МУ-44-116 "Рекомендуемые максимальные пределы контаминации окружающей среды в рабочих условиях") могут использоваться методы, эквивалентные тем, которые вошли в данные методические указания.
3. Определения
В данных методических указаниях используются следующие определения:
3.1. асептическое наполнение: часть асептического процесса, в котором стерильный продукт разливается и упаковывается с использованием стерильных емкостей и крышек в критических производственных зонах;
3.2. асептическое производство: включает все операции приготовления МИБП, в том числе и асептическое наполнение емкостей продуктом в контролируемых условиях среды, где воздухоподача, материалы, оборудование и персонал соответствующим образом контролируются на приемлемые уровни микробной контаминации и контаминации механическими частицами;
3.3. асептические производственные зоны (АПЗ): контролируемая среда, состоящая из нескольких зон, в которых воздухоподача, материалы, оборудование и персонал контролируются на приемлемые уровни микробной контаминации и контаминации механическими частицами;
3.4. аэрозольный пробоотборник: прибор, используемый для отбора заданных объемов воздуха за определенный временной промежуток в целях определения количественного содержания микроорганизмов или механических частиц;
3.5. биологическая нагрузка: общее количество живых микроорганизмов в продукте перед процессом стерилизации;
3.6. валидация (аттестация): получение документированного подтверждения того, что конкретный производственный процесс обеспечит с высокой степенью надежности получение продукта, отвечающего заранее установленным спецификациям и показателям качества;
3.7. контролируемая среда: среда производственных помещений, в которой содержание механических и живых частиц поддерживается на определенных уровнях;
3.8. корректирующие действия: действия, которые необходимо предпринимать в случае, если результаты контроля окружающей среды выявляют превышение уровня действия;
3.9. колониеобразующая единица (КОЕ): число живых микроорганизмов, определяемое по проросшим единичным колониям на плотных питательных средах, содержащееся в определенных объемах исследуемых проб;
3.10. критические производственные зоны: локальные зоны асептического производства, в которых совершаются асептические манипуляции с продуктом, асептический монтаж оборудования, операции наполнения и укупорки, где продукт подвергается наибольшему риску контаминации. Данные зоны, как правило, располагаются в классах чистоты А, В (100) в соответствии с МУ-44-116;
3.11. критические поверхности: поверхности, находящиеся в зоне выполнения асептических операций, непосредственно контактирующие со стерильным материалом (емкостями, инструментарием и пр.);
3.12. окружающая флора: микроорганизмы, выделенные из производственной среды совокупностью микробиологических методов исследования;
3.13. план отбора проб: документ, описывающий методику отбора проб в контролируемой среде, устанавливающий точки отбора проб, частоту и количество регулярно проводимых исследований, методы анализа данных и интерпретацию полученных результатов;
3.14. программа мониторинга окружающей среды: документально определенная программа, которая описывает правила текущего мониторинга производственной среды по всем контролируемым параметрам: влажность, температура, скорость воздушных потоков, уровень перепада давления между помещениями, уровень контаминации бактериальными и механическими частицами и включает в себя план мероприятий при превышении результатов контроля уровня действия;
3.15. стерилизация: валидируемый процесс, используемый для освобождения продукта от живых микроорганизмов;
3.16. стерильный: заявленный как свободный от живых микроорганизмов;
3.17. терминальная стерилизация: процесс, при котором продукт стерилизуется в своей конечной емкости;
3.18. точка отбора пробы: отраженное в документах место в контролируемой зоне, где производится отбор пробы для дальнейших микробиологических исследований. Точка выбирается, исходя из потенциального влияния на стерильность продукта;
3.19. уровень действия: установленный критический уровень содержания микробов или механических частиц, требующий немедленного вмешательства и корректирующих действий, если он превышен;
3.20. уровень тревоги: установленный докритический уровень содержания микробов или механических частиц, дающий раннее предупреждение о возможном отклонении от нормальных рабочих условий производства, не требующий немедленного вмешательства и исправляющих действий, но который является поводом для проведения дополнительных контролей;
3.21. чистая зона: заданное пространство, где концентрация живых и механических частиц в воздушной среде поддерживается в установленных пределах в соответствии с классом чистоты;
3.22. чистая комната: комната, где концентрация живых и механических частиц в воздушной среде поддерживается на заданном уровне, определяемым классом чистоты.
4. Программа микробиологического мониторинга контролируемой среды
Основной целью программы оценки микробиологического состояния производственной среды является постоянная гарантия стабильности асептических условий производства МИБП, выявление начальных отклонений и выработка корректирующих действий до возникновения ситуаций, приводящих к появлению нестерильной продукции.
Метод контроля стерильности готового препарата (ГФ IX, вып.2, с.187) основан на выборочном исследовании части серии и не дает полной гарантии стерильности каждой емкости в серии. Поэтому необходимо проводить промежуточные тесты на стерильность препарата в процессе производства, а также качественный и количественный контроль асептических условий (класса чистоты рабочих зон).
4.1. Программа микробиологического мониторинга окружающей среды в АПЗ должна охватывать:
4.2. Текущий контроль в принципе не может и не должен выявить или подсчитать все микроорганизмы, присутствующие в контролируемой среде. Он может только показать, что все ключевые системы, контролирующие состояние производственной среды, работают в соответствии с установленными требованиями и лимиты бактериальной нагрузки не превышены.
4.3. Задачей микробиологического контроля является получение репрезентативной оценки бактериальной нагрузки производственной среды.
4.4. Стабильность асептических условий производственной среды должна обеспечиваться:
4.5. Перечисленные поддерживающие функции должны обеспечиваться персоналом соответствующей квалификации, обученным правилам работы в АПЗ.
4.6. Программа микробиологического мониторинга производственной среды является документом, который периодически пересматривается и совершенствуется, (см. также раздел 17 Методических рекомендаций МУ-44-116).
5. Общие принципы процедуры микробиологического мониторинга
5.1. Вне зависимости от выбора метода тестирования, подготовка, технологический процесс, стерилизация, асептические процессы, контрольные тесты, очистка и дезинфекция оборудования и помещений, качество оборудования и используемых материалов должны полностью отвечать требованиям GMP.
5.2. При контроле используются только откалиброванное оборудование и приборы, прошедшие метрологическую аттестацию.
5.3. Любой метод, выбранный для текущего контроля должен предварительно пройти валидацию.
5.4. При текущем мониторинге предпочтительно использовать те же методы, что и при первичной аттестации чистого помещения или зоны. Любые изменения методов контроля могут повлиять на результаты.
5.5. Ростовые свойства питательных сред, используемых для микробиологических исследований, должны подтверждаться использованием соответствующих штаммов микроорганизмов.
5.6. В письменных инструкциях, описывающих процедуру микробиологического мониторинга, следует четко излагать шаг за шагом последовательность проведения исследований.
5.7. Полученные результаты должны регистрироваться в утвержденных по форме протоколах (журналах). В случаях превышения установленных верхних лимитов бактериальной нагрузки в АПЗ должны быть отражены все проведенные расследования и мероприятия.
5.8. Персонал, выполняющий программу микробиологического мониторинга должен быть компетентен в соответствующих научных дисциплинах, адекватно обучен и иметь необходимые полномочия.
5.9. Все исследования обычно проводятся производственными отделениями. Однако Отдел гарантии качества или Технологический отдел должен проводить периодические, независимые исследования, повторяющие программу микробиологического мониторинга. Периодичность обследования и протоколы утверждаются руководством предприятия.
5.10. Установление соответствующего уровня тревоги и уровня действия, выбор адекватных методов контроля являются предметами, постоянно требующими пересмотра. Все соответствующие решения должны приниматься уполномоченным персоналом.
5.11. Уровни тревоги и действия, частота контроля, число точек отбора проб обычно являются более строгими параметрами при процессе асептического розлива, чем при производстве терминально стерилизуемого продукта.
5.12. Процедуры микробиологического мониторинга обычно включают следующие шаги:
5.13. Данные мониторинга следует учитывать для совершенствования практики уборки и дезинфекции.
5.14. Основные факторы, которые необходимо учитывать при определении методологии проведения тестов, приводятся в приложении.
6. Выбор точек отбора проб
6.1. Расположение точек отбора проб из воздуха и с поверхностей является индивидуальным для каждого производителя и устанавливается в процессе первичной или повторной аттестации чистого помещения или чистой зоны.
6.2. При запуске в эксплуатацию нового чистого помещения или зоны проводится изучение ее функционирования.
Процесс валидации (аттестации) включает в себя:
6.3. Периодическая валидация проводится каждые полгода.
6.4. Карта микробной контаминации, полученная при аттестации чистого помещения, выявляет точки наибольшего бактериального загрязнения. Эта карта служит основой для составления плана отбора проб при текущем контроле, учитывая потенциальное влияние на контаминацию продукта.
6.5. Зоны непосредственного контакта воздуха и поверхностей с емкостями, содержащими стерильный продукт, являются критическими и тщательно контролируемыми. При операциях асептического наполнения к таким зонам относятся места подачи стерильных емкостей и крышек и места наполнения.
6.6. Ключевыми точками для отбора проб при текущем мониторинге являются следующие:
6.7. В первую очередь микробиологическому мониторингу должны подвергаться следующие элементы производственной среды:
6.8. Система подготовки и распределения воды также может быть источником контаминации. Микробиологическое качество воды является ключевым фактором для производства МИБП, так как она используется для приготовления препаратов и для различных процессов мойки и ополаскивания. В системе распределения воды следует выбрать контрольные точки, при необходимости оборудовать порты для отбора проб.
6.9. Ниже приводятся некоторые примеры точек отбора проб, которые могут считаться наиболее существенными.
6.10. Перечисленные выше точки отбора проб выбираются каждым предприятием индивидуально, с учетом конкретных производственных условий и зависят также от:
6.11. Число контрольных точек на одно помещение при текущем контроле:
7. Частота и время отбора проб
Система | Точка отбора пробы |
Воздух (линия розлива) | Около наполняемых емкостей |
Воздух помещения | Точки входа и выхода вентиляционной системы, зона манипуляций с продуктом |
Вода | Кран водопользования или наполнительной емкости |
Поверхность(помещение) | Рабочий стол |
Поверхность (оборудование) | Поверхности, контактирующие с продуктом |
Оператор линии розлива | Руки в перчатках |
Сжатый воздух | Наиболее удаленная от компрессора точка |
Ламинарный поток | Около объектов, создающих возмущение потока |
7.1. Частота отбора проб зависит от установленного класса чистоты для данного помещения и от вида обработки, которой подвергается продукт далее в процессе его производства.
7.2. Зоны класса А (100) должны проверяться каждую рабочую смену, зоны класса В (100) также могут проверяться каждую смену или ежедневно, в то время как вспомогательные зоны могут проверяться с меньшей периодичностью, например: зоны класса С (10000) - два раза в неделю, зоны класса D (100000) - еженедельно.
7.3. Для сравнительного анализа состояний производственной среды отбор проб должен проводиться в одно и то же фиксированное в плане время, т.е. приходиться на равнозначную по интенсивности технологического процесса временную точку.
7.4. Следующие временные точки для отбора проб являются обязательными:
Контроль элементов среды | Время |
Воздух | Во время работы |
Поверхности | Перед работой |
Руки оператора | Перед выполнением асептических манипуляций |
Дополнительно могут проводиться исследования по окончании работы для оценки бактериальной нагрузки за рабочую смену.
7.5. Периодичность проведения микробиологического мониторинга может значительно варьироваться в зависимости от:
7.6. Технологический процесс, включающий ручные операции, имеет повышенный риск контаминации продукта, в этих случаях частоту проведения текущего контроля следует увеличить.
7.7. Ниже в таблице приводится рекомендуемая периодичность проверки контролируемой среды.
8. Объем пробы
Контроль элементов среды | Время |
Воздух | Во время работы |
Поверхности | Перед работой |
Руки оператора | Перед выполнением асептических манипуляций |
8.1. Объем пробы воздуха должен быть достаточным как для обнаружения микроорганизмов в заданном объеме воздуха, так и для роста дискретных и пригодных к подсчету колоний на фильтрующей мембране или агаровой пластине.
8.2. Оптимальным количеством КОЕ, выросших на мембране, считается менее 30 и на агаровых пластинах (чашках Петри) - менее 300 колоний.
8.3. Для импакторов и центрифужных пробоотборников одним из ограничивающих факторов является высыхание поверхности агара при больших объемах проб, а также возможность повреждения целостности агарового слоя (растрескивание).
8.4. Объем пробы воздуха должен устанавливаться опытным путем, с учетом характеристик используемого пробоотборника и концентрации микроорганизмов в тестируемой зоне.
8.5. Для снятия смывов с плоских поверхностей рекомендуемой является площадь размером 24-30 см2, а также стандартные места, например, отпечатки пальцев на агаре, смыв тампоном с предплечий рук на халатах у операторов.
9. Выбор питательной среды
9.1. Выбор питательной среды для проведения микробиологического мониторинга является одним из важных факторов. Питательная среда должна поддерживать рост широкого спектра микроорганизмов, включая дрожжи и грибы.
9.2. Приемлемой средой для контроля микробной загрязненности является среда N 1 (по ГФ изд.XI, вып.2, с.200) для бактерий и среда N 2 (агар Сабуро) для дрожжей и грибов. Посевы на среде N 1 инкубируются при температуре от 30°С до 35°С в течение 48 ч, на агаре Сабуро - от 20°С до 25°С в течение 72 ч.
Зоны отбора проб | Периодичность отбора проб |
Асептически изготовляемые МИБП | |
Помещения или зоны А (100) | каждую смену |
Окружающие зоны В (100) для зон класса А (100) | каждую смену или ежедневно |
Вспомогательные зоны С (10000) | два раза в неделю |
Зоны класса D (100000) или вспомогательные зоны потенциального воздействия на продукт | еженедельно |
Другие вспомогательные зоны, не имеющие потенциального контакта с продуктом | один раз в две недели |
Терминально стерилизуемые МИБП* | |
Зоны прямого контакта с продуктом | один раз в неделю |
Зоны, не имеющие прямого воздействия на продукт | один раз в две недели |
Стерильные МИБП для наружного применения | |
Зоны прямого контакта с продуктом** | один раз в две недели |
Зоны, не имеющие прямого воздействия на продукт | один раз в три недели |
* если существуют требования к проверке биологической нагрузки продукта
** если в течение 12 месяцев не обнаруживается значительных отклонений в результатах, полученных при проверке, периодичность можно уменьшить до одного раза в три недели.
9.3. Перед исследованиями, разлитые в чашки Петри или на пластины, питательные среды необходимо выдерживать в термостате при температуре от 30° до 35°С в течение 24 ч для подтверждения их стерильности. Проросшие чашки бракуют.
9.4. Ростовые свойства питательных сред должны быть проверены соответствующими тест штаммами (для среды N 1 и среды N 2 по ГФ изд.XI, вып.2, с.208 "Требования к ростовым свойствам питательных сред").
9.5. При контроле поверхностей, предварительно обработанных дезинфицирующими растворами, которые могут попадать в питательную среду и ингибировать рост микроорганизмов, для инактивации действия химических агентов необходимо добавлять в питательные среды нейтрализаторы, например, твин-80, лецитин или другие (см. ГФ изд.XI, вып.2, с.194 "Определение антимикробного действия лекарственного средства").
10. Идентификация выделенных микроорганизмов
10.1. Все выявленные в процессе мониторинга окружающей среды микроорганизмы подлежат обязательной макроскопической (форма, цвет, консистенция колоний) и микроскопической идентификации окрашенных по Граму мазков. Результаты исследований должны регистрироваться в документах, где указывают основные морфологические признаки: отношение к окраске по Граму, наличие или отсутствие спорообразования, форма микроорганизмов (кокки, палочки, овоиды и т.д).
10.2. Кроме указанных методов морфологической идентификации существуют также:
Производитель может по своему усмотрению применять любые дополнительные современные методы идентификации микроорганизмов, в т.ч. специальные дифференциальные среды для выявления определенных групп микроорганизмов, или специальные методы, например метод двухслойного агара для определения анаэробной контаминации.
10.3. При обнаружении споровых бактерий или грибов необходимо проводить дополнительные меры дезинфекции помещений.
Идентификация дает возможность предположить источник контаминации, основываясь на преимущественном распространении микроорганизмов во внешней среде.
10.4. Люди, участвующие в производственном процессе, также являются источником контаминации. Ниже приведены группы микроорганизмов, преимущественно встречающиеся в определенных участках тела человека.
11. Микробиологические условия и уровни действия для контролируемой среды
В фармацевтической промышленности на протяжении многих лет используются установленные уровни содержания микроорганизмов, связанные с классом чистоты помещений - А (100), В (100), С (10000) и D (100000), классификация принятая ВОЗ и МСА (Серия технических докладов Всемирной организации здравоохранения N 823).
Данные уровни считаются достижимыми при использовании текущих технологий для контролируемых сред и приведены в Таблице 1.3 Приложения 1 и Таблице 4.1 Приложения 4 Методических рекомендаций МУ-44-116 "Асептическое производство медицинских иммунобиологических препаратов".
Значения, приведенные ниже в таблицах, дополняют и конкретизируют требования к классам чистоты в отношении поверхностей оборудования и помещений, одежды и рук персонала. Данные по колониеобразующим единицам (КОЕ) относятся к неспорообразующим микроорганизмам. Присутствие спорообразующих бактерий, грибов и дрожжей недопустимо. При их выявлении необходимо проведение дополнительных мер по дезинфекции и выявлению источников контаминации.
Микроорганизмы | Пример | Источник |
Грамотрицательные | Pseudomonas | вода |
Грамположительные кокки | Staphylococcus | люди |
Грамположительные палочки | Propionibacterium | люди, пыль |
Грамположительные палочки (споры) | Bacillus | пыль |
Плесень, дрожжи | Aspergillus | пыль |
При использовании смывов с поверхностей необходимо, чтобы площадь снятия смыва была не менее 24 см2 и не более 30 см2.
Рекомендуемые уровни чистоты одежды и рук персонала, работающих в контролируемых зонах в колониеобразующих единицах (КОЕ)
Участки тела человека | Группы микроорганизмов |
Кожа | Corynebacterium Staphylococcus, Bacillus |
Нос | Micrococcus, Corynebacterium Staphylococcus |
Подмышечные впадины | Micrococcus, Corynebacterium, Sarcina |
Десны | Streptococcus, Corynebacterium |
Приведенные в данной таблице уровни микробной контаминации одежды и рук персонала устанавливаются на конец рабочей смены, при обычных рабочих условиях. В начале рабочей смены одежда и перчатки должны быть стерильными. Контроль стерильной одежды проводят 1 раз в две недели - непосредственно после стерилизации одежды. Контролируют не менее 3-х комплектов из каждой загрузки автоклава.
12. Уровни тревоги и действия и корректирующие мероприятия
Анализ результатов текущего контроля должен давать постоянную оценку соответствия асептического процесса установленному уровню, т.е. удалось ли достичь установленного класса чистоты для данного помещения.
В таблицах 4.1 и 4.2 Приложения 4 "Общий микробиологический мониторинг" Методических рекомендаций МУ-44-116 приводятся уровни действия для среды критических и некритических зон, а также мероприятия, рекомендуемые в случае превышения данного уровня действия.
Программа корректирующих мероприятий при превышении установленного уровня действия должна быть разработана каждым производителем индивидуально, с учетом конкретных производственных условий, документально оформлена. Протоколы заполняются результатами предусмотренных дополнительных контролей, выводы проведенных расследований подписываются ответственными лицами.
Рекомендуемые уровни чистоты поверхностей оборудования и помещения для контролируемых зон в колониеобразующих единицах (КОЕ)
Класс | КОЕ/контактная пластина* |
В (100) | 2 |
С (10000) | 510 (на полу) |
* площадь контактной пластины - от 24 см2 до 30 см2
Уровни тревоги и действия должны периодически пересматриваться в соответствии с модернизацией процессов или потоков и технологий.
13. Документация
Программа микробиологического мониторинга производственной среды должна быть составлена в виде рабочего документа, включающего:
Класс | КОЕ/контактная пластина | |
Перчатки | Маска, предплечья, бахилы (общее на 1 человека) | |
В (100) | 3 | 5 |
С (10000) | 10 | 20 |
Формы протоколов контроля элементов производственной среды должны отражать следующие параметры:
Приложение А
Методы контроля
В данном приложении рассматриваются преимущества и недостатки основных методов, используемых в микробиологическом мониторинге для тестирования воздушной среды, рабочих поверхностей, одежды и рук персонала.
Приведенный в данных Методических рекомендациях список литературы может помочь производителю в выборе приемлемых методов контроля.
1. Методы тестирования воздушной среды
Микроорганизмы потенциально всегда присутствуют в воздухе контролируемой рабочей зоны, так как НЕРА фильтры, используемые для очистки, не имеют абсолютной 100% эффективности, даже тогда, когда работают в специфицированных условиях (класс чистоты А (100) и В (100)).
Основной целью микробиологического контроля воздуха асептической зоны является определение уровня и спектра микробной контаминации, чтобы оценить вероятность ее проникновения в производимый продукт.
Для контроля микробной контаминации воздуха применяют два метода - пассивный (качественный) и активный (количественный).
К числу наиболее популярных приборов, используемых в активных методах микробиологического контроля воздуха, относятся импакторы и центрифужные пробоотборники, где применяется плотная агаровая питательная среда.
Пассивный метод заключается в экспозиции открытой плотной питательной среды в течение определенного периода времени. Главным недостатком метода является выявление только больших быстрооседающих частиц и неопределенность в объеме отобранной пробы. Фактически данный метод является качественным и позволяет лишь определить спектр присутствующих микроорганизмов.
1.1. Активные методы и приборы для контроля микробной контаминации воздуха.
Для выбора приемлемого метода активного отбора проб следует учитывать следующие факторы:
Выбор прибора и правильность его использования является областью ответственности производителя.
Наиболее часто в фармацевтической промышленности используются щелевые импакторы и центрифужные пробоотборники типа RCS.
Учитывая приемлемость по основным характеристикам и удобство использования, рекомендуется применять аэрозольные пробоотборники типа "Флора-100" или Biotest RCS (см. Приложение Б "Аэрозольные пробоотборники для контроля бактериальной контаминации воздуха").
1.2. Пассивный метод контроля микробной контаминации воздуха
Метод заключается в экспозиции плотной питательной среды в открытых чашках Петри.
Частицы, присутствующие в воздухе, со временем осаждаются на поверхность агара. Время экспозиции составляет от 15 мин до нескольких часов. Однако длительная экспозиция приводит к высыханию поверхности питательной среды и к ухудшению условий сохранения и культивирования бактерий.
Этот метод широко распространен и его применение целесообразно в сочетании с активным методом контроля микробной контаминации воздуха.
Открытые чашки Петри располагают в нескольких точках. Например, при розливе препаратов - как можно ближе к наполняющим иглам и в точки "наихудших условий". В асептических зонах класса А (100) и В (100) при экспозиции чашек Петри с питательной средой в течение 30 мин во время работы допускается рост одной, редко двух колоний.
Преимущества | Ограничения |
Простота использования | Отбор только быстро оседающих больших частиц |
Не требует процесса посева | Влияние температуры на эффективность сбора |
Различные типы питательной среды могут быть использованы для проращивания плесени, грибов, всего спектра микроорганизмов или отдельного вида | Сильное влияние скорости и направления воздушного потока по отношению к поверхности среды на результаты теста |
Очень экономичен | Неопределенность объема отобранной пробы |
2. Методы отбора проб с поверхностей
Для контроля микробной контаминации рабочих поверхностей используются следующие методы:
Репрезентативной считается проба, снятая с поверхности площадью от 24 см2 до 30 см2.
Если накопленные результаты текущего мониторинга свидетельствуют о постоянном присутствии определенной группы микроорганизмов, то для их идентификации может быть использован соответствующий тип питательной среды.
Смывы с поверхностей проводят стерильным ватным тампоном, укрепленном на стеклянном или металлическом держателе, вмонтированном в ватно-марлевую пробку пробирки. В пробирке должно содержаться приблизительно 2 мл стерильной воды для инъекций.
В чашки Петри разливают по 20-25 мл питательной среды N 1 для бактерий и среды N 2 для грибов и дрожжей (по ГФ изд.XI, вып.2). Перед исследованиями чашки с разлитой средой выдерживают в термостате в течение 1 суток при температуре от 30°С до 35°С. Проросшие чашки не используют.
Смывы проводят увлажненным тампоном с поверхности площадью от 24 см2 до 30 см2.
После взятия пробы провести несколько раз по поверхности питательной среды в двух параллельных чашках Петри со средой N 1 и N 2. После отбора проб чашки Петри помещают в термостат для инкубации при температуре от 30°С до 35°С в течение 48 ч для среды N 1, от 20°С до 25°С в течение 72 ч для среды N 2. После истечения срока инкубации проводят подсчет колоний на двух параллельных чашках, делают мазки, фиксируют их и окрашивают по Граму, микроскопируют.
На результаты тестирования могут повлиять следующие факторы:
Контактные пластины готовятся с соответствующей плотной питательной средой, разливая ее на специальные пластины или таким образом, чтобы поверхность агара выступала над краем чашки Петри.
При исследовании снимают крышку с чашки и стерильная поверхность питательной среды накладывается на гладкую ровную поверхность. После снятия отпечатка эту поверхность необходимо обработать спиртом или любым другим дезинфектантом для удаления остатков питательной среды. После инкубации в соответствии со сроками и температурой для используемых сред (например, среды N 1 и N 2) проводят подсчет колоний и микроскопируют окрашенные по Граму мазки.
Метод контактных пластин подходит для тестирования гладких и ровных поверхностей, таких как рабочий стол, стены, пол или одежда персонала.
3. Методы определения микробной контаминации одежды и перчаток персонала
3.1. Для определения микробной контаминации перчаток персонала используют следующий метод:
Отпечатки пяти пальцев каждой руки делают на поверхность плотной питательной среды, например среды N 1 и среды N 2 (параллельно). Чтобы касание было полным, рекомендуется сделать скользящее движение пальцами по всей поверхности агара. Руки после контакта с агаром тщательно обрабатывают спиртом.
Рекомендуется следующая частота тестирования: не менее одного раза в рабочую смену для АПЗ, для других - от одного раза в неделю до одного раза в месяц в зависимости от степени автоматизации технологического процесса.
3.2. Микробная контаминация одежды персонала обычно определяется на предплечьях с помощью контактных пластин. Также проверяются бахилы.
Можно применять метод смыва тампоном. Для этого делают смывы увлажненным тампоном с 4 участков площадью по 25 см2 каждый на нижней части двух рукавов, верхней передней поверхности комбинезона (халата) и шлеме.
После тестирования одежда не должна более использоваться в АПЗ.
Приложение Б
Аэрозольные пробоотборники для контроля
бактериальной контаминации воздуха
В данном приложении описан аэрозольный пробоотборник "Флора-100", имеющий российский сертификат соответствия РОСС RU ИМ04.Н.00128 N 02549128, выданный органом по сертификации АНО "Центр ЦСМИ ВНИИ Медприбор". Пробоотборник рекомендуется для работы во всех классах чистоты А, В (100); С (10000) и D (100000). Возможно применение любого подобного пробоотборника отечественного и зарубежного производства, имеющего сертификат соответствия и удовлетворяющего по диапазону пробоотбора требованиям, предъявляемым уровню допустимой контаминации к классам чистоты А, В (100), С (10000) и D (100000).
1. Область применения и ограничения по использованию пробоотборника "Флора-100"
1.1. Область применения.
Определение концентрации жизнеспособных микроорганизмов при проведении аттестации и текущего контроля классов чистоты воздуха в чистых комнатах и чистых зонах.
1.2. Ограничения по применению.
Рекомендации не распространяются на методы аттестации и контроля уровня вирусологического загрязнения воздуха.
2. Устройство и принцип работы пробоотборника "Флора-100"
Работа пробоотборника основана на разгоне воздушного потока с помощью многосопловой решетки до высокой линейной скорости и инерционном осаждении микроорганизмов на плотную питательную среду, установленную перпендикулярно потоку.
3. Основные технические данные и характеристики пробоотборника "Флора-100"
Пробоотборник рассчитан на эксплуатацию при температуре от 0°С до +50°С при относительной влажности воздуха не более 80%.
Объемная скорость отбора пробы составляет: - 180 литров/мин.
Режимы отбора проб: - 25, 100, 250 и 2000 литров.
Диапазон измеряемых концентраций микроорганизмов - (104 КОЕ) (м-3)
3.1. Метрологическая поверка.
Требования по метрологической поверке должны указываться в паспортных данных на прибор.
4. Конструкция пробоотборника "Флора-100"
Пробоотборник оформлен в виде переносного портативного прибора, состоящего из корпуса, в котором смонтированы блок управления на печатных платах, аспиратор и аккумуляторные батареи; и съемной ситовой решетки. Корпус и ситовая решетка выполнены из анодированного алюминиевого сплава. Лицевая панель с органами управления смонтирована на корпусе и герметично закрыта гибкой пластиной. Прибор снабжен съемным электрошнуром с блоком питания.
5. Меры безопасности
При подготовке прибора к работе необходимо блок питания присоединить сначала к пробоотборнику, а затем включить в сеть. Съем ситовой решетки и замену любого элемента производить после отключения прибора и полной остановки двигателя аспиратора.
6. Подготовка пробоотборника "Флора-100" к работе
7. Отбор пробы воздуха пробоотборником "Флора-100"
8. Обработка результатов
1. Для расчета концентрации микроорганизмов в воздухе определяют наиболее вероятное число микробных частиц в пробе.
При количестве колоний, не превышающем 35, наиболее вероятное число колониеобразующих единиц равно числу колоний. Если количество более 35, наиболее вероятное число P колониеобразующих единиц определяется по формуле:
,
где N - количество отверстий в сопловой решетке (N=367);
n - число колоний.
В таблице представлены значения наиболее вероятного числа колониеобразующих единиц для пробоотборника "Флора-100" (см. Таблицу).
Концентрация микроорганизмов в пробе воздуха определяется путем деления числа колоний или наиболее вероятного числа колониеобразующих единиц на объем отобранной пробы.
Таблица
n | P | n | P | n | P | n | P | n | P | n | P |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
10 |
11 | 12 |
1 | 1 | 32 | 33 | 63 | 69 | 94 | 108 | 125 |
153 |
156 | 203 |
2 | 2 | 32 | 35 | 64 | 70 | 95 | 110 | 126 |
154 |
157 | 205 |
3 | 3 | 34 | 36 | 65 | 71 | 96 | 111 | 127 |
156 |
158 | 206 |
4 | 4 | 35 | 37 | 66 | 73 | 97 | 112 | 128 |
157 |
159 | 208 |
5 | 5 | 36 | 38 | 67 | 74 | 98 | 114 | 129 |
159 |
160 | 210 |
6 | 6 | 37 | 39 | 68 | 75 | 99 | 115 | 130 |
160 |
161 | 212 |
7 | 7 | 38 | 40 | 69 | 76 | 100 | 117 | 131 |
162 |
162 | 213 |
8 | 8 | 39 | 41 | 70 | 78 | 101 | 118 | 132 |
163 |
163 | 215 |
9 | 9 | 40 | 42 | 71 | 79 | 102 | 119 | 133 |
165 |
164 | 217 |
10 | 10 | 41 | 43 | 72 | 80 | 103 | 121 | 134 |
166 |
165 | 219 |
11 | 11 | 42 | 45 | 73 | 81 | 104 | 122 | 135 |
168 |
166 | 221 |
12 | 12 | 43 | 46 | 74 | 83 | 105 | 123 | 136 |
170 |
167 | 222 |
13 | 13 | 44 | 47 | 75 | 84 | 106 | 125 | 137 |
171 |
168 | 224 |
14 | 14 | 45 | 48 | 76 | 85 | 107 | 126 | 138 |
173 |
169 | 226 |
15 | 15 | 46 | 49 | 77 | 86 | 108 | 128 | 139 |
174 |
170 | 228 |
16 | 16 | 47 | 50 | 78 | 88 | 109 | 129 | 140 |
176 |
171 | 230 |
17 | 17 | 48 | 51 | 79 | 89 | 110 | 131 | 141 |
178 |
172 | 232 |
18 | 18 | 49 | 53 | 80 | 90 | 111 | 132 | 142 |
179 |
173 | 234 |
19 | 19 | 50 | 54 | 81 | 91 | 112 | 133 | 143 |
181 |
174 | 235 |
20 | 21 | 51 | 55 | 82 | 93 | 113 | 135 | 144 |
183 |
175 | 237 |
21 | 22 | 52 | 56 | 83 | 94 | 114 | 136 | 145 |
184 |
176 | 239 |
22 | 23 | 53 | 57 | 84 | 95 | 115 | 138 | 146 |
186 |
177 | 241 |
23 | 24 | 54 | 58 | 85 | 97 | 116 | 139 | 147 |
187 |
178 | 243 |
24 | 25 | 55 | 59 | 86 | 98 | 117 | 141 | 148 |
189 |
179 | 245 |
25 | 26 | 56 | 60 | 87 | 99 | 118 | 142 | 149 |
191 |
180 | 247 |
26 | 27 | 57 | 62 | 88 | 100 | 119 | 143 | 150 |
193 |
181 | 249 |
27 | 28 | 58 | 63 | 89 | 102 | 120 | 145 | 151 |
194 |
182 | 251 |
28 | 29 | 59 | 64 | 90 | 103 | 121 | 147 | 152 |
196 |
183 | 253 |
29 | 30 | 60 | 65 | 91 | 104 | 122 | 148 | 153 |
198 |
184 | 255 |
30 | 31 | 61 | 67 | 92 | 106 | 123 | 150 | 154 |
199 |
185 | 257 |
31 | 32 | 62 | 68 | 93 | 107 | 124 | 151 | 155 |
201 |
186 | 259 |
187 | 259 | 217 | 325 | 247 | 406 | 277 | 510 | 307 |
656 |
337 | 902 |
183 | 161 | 218 | 328 | 248 | 409 | 278 | 514 | 308 |
662 |
338 | 913 |
189 | 263 | 219 | 330 | 249 | 412 | 279 | 518 | 309 |
668 |
339 | 926 |
190 | 265 | 220 | 333 | 250 | 415 | 280 | 523 | 310 |
674 |
340 | 938 |
191 | 267 | 221 | 335 | 251 | 417 | 281 | 527 | 311 |
681 |
341 | 951 |
192 | 269 | 222 | 338 | 252 | 422 | 282 | 531 | 312 |
687 |
342 | 965 |
193 | 271 | 223 | 340 | 253 | 425 | 283 | 535 | 313 |
694 |
343 | 979 |
194 | 273 | 224 | 343 | 254 | 428 | 284 | 539 | 314 |
700 |
344 | 994 |
195 | 275 | 225 | 345 | 255 | 431 | 285 | 544 | 315 |
707 |
345 | 1009 |
196 | 278 | 226 | 348 | 256 | 434 | 286 | 548 | 316 |
714 |
346 | 1025 |
197 | 280 | 227 | 350 | 257 | 438 | 287 | 553 | 317 |
721 |
347 | 1042 |
198 | 282 | 228 | 353 | 258 | 441 | 288 | 557 | 318 |
728 |
348 | 1059 |
199 | 284 | 229 | 355 | 259 | 444 | 289 | 562 | 319 |
736 |
349 | 1078 |
200 | 286 | 230 | 358 | 260 | 448 | 290 | 567 | 320 |
743 |
350 | 1097 |
201 | 288 | 231 | 361 | 261 | 451 | 291 | 571 | 321 |
751 |
351 | 1117 |
202 | 291 | 232 | 363 | 262 | 455 | 292 | 576 | 322 |
759 |
352 | 1139 |
203 | 293 | 233 | 366 | 263 | 458 | 293 | 581 | 323 |
767 |
353 | 1162 |
204 | 295 | 234 | 369 | 264 | 462 | 294 | 586 | 324 |
775 |
354 | 1186 |
205 | 297 | 235 | 372 | 265 | 465 | 295 | 591 | 325 |
783 |
355 | 1212 |
206 | 299 | 236 | 374 | 266 | 469 | 296 | 596 | 326 |
792 |
356 | 1241 |
207 | 302 | 237 | 377 | 267 | 472 | 297 | 601 | 327 |
800 |
357 | 1271 |
208 | 304 | 238 | 380 | 268 | 476 | 298 | 606 | 328 |
809 |
358 | 1305 |
209 | 306 | 239 | 383 | 269 | 480 | 299 | 611 | 329 |
819 |
359 | 1341 |
210 | 309 | 240 | 386 | 270 | 483 | 300 | 617 | 330 |
828 |
360 | 1382 |
211 | 311 | 241 | 389 | 271 | 487 | 301 | 622 | 331 |
838 |
361 | 1428 |
212 | 313 | 242 | 391 | 272 | 491 | 302 | 627 | 332 |
848 |
362 | 1480 |
213 | 316 | 243 | 394 | 273 | 495 | 303 | 633 | 333 |
858 |
363 | 1542 |
214 | 318 | 244 | 397 | 274 | 498 | 304 | 639 | 334 |
868 |
364 | 1615 |
215 | 320 | 245 | 400 | 275 | 502 | 305 | 644 | 335 |
879 |
365 | 1707 |
216 | 323 | 246 | 403 | 276 | 506 | 306 | 650 | 336 |
890 |
366 | 1829 |
|
367* |
* при количестве колоний 367 и более проба считается недействительной.
МУК 4.2.1774-03
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Метод микробиологического измерения концентрации клеток
микроорганизма Penicillium canescens F-832 ВКПМ продуцента ксиланазы
в атмосферном воздухе населенных мест
Дата введения: 2003-12-01
УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 24 октября 2003 г.
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens F-832 ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ".
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма-продуцента ксиланазы
Микроорганизм Penicillium canescens F-832 является продуцентом фермента ксиланазы. Культура образует цепочки спор обычно прямые с гладкой оболочкой. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. На сусло-агаре на 3 сутки роста при температуре 30 °С образует округлые радиально-складчатые морщинистые колонии с кремовым или сероватым налетом, диаметром 2-3 мм. На 4-5 сутки инкубации размеры колонии достигают 5-7 мм, конфигурация и складчатость колоний не изменяется, образуется воздушный мицелий со спорами бежевато-серого цвета, подошва колоний оранжево-коричневая.
Штамм устойчив практически ко всем широко известным антибиотикам.
ПДК штамма в атмосферном воздухе 200 кл/м, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 мвоздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента ксиланазы на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результат продукции ксиланазы на среде с окрашенной целлюлозой.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) |
ТУ 64-12791-77 |
Термостаты электрические суховоздушные или водяные |
|
Автоклав электрический |
ГОСТ 9586-75 |
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами |
|
Холодильник бытовой |
|
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 |
|
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 |
|
Лупа с увеличением х10 |
|
Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм |
|
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл |
ГОСТ 10515-75 |
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл |
ГОСТ 10515-75 |
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл |
|
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл |
|
Секундомер |
ГОСТ 9586-75 |
Барометр |
ГОСТ 24696-79 |
Марля медицинская |
ГОСТ 9412-77 |
Вата медицинская гигроскопическая |
ГОСТ 5556-81 |
5.2. Реактивы, растворы
Антибиотики: группы пенициллина, тетрациклина, цефалоспорина и др. |
|
Спирт этиловый ректификат |
ГОСТ 5962-67* |
_______________ |
|
Среда для штамма-продуцента: |
|
агаризованное пивное сусло 5-6 °Б для штамма-продуцента (агар - 1,8%, рН 5,9-6,1, режим стерилизации 1,1-1,2 атм в течение 30 мин) |
|
Бенгальский розовый |
|
Диметилсульфоксид |
|
Селективная среда для штамма-продуцента, состав среды: KНРО - 1 г; MgSO7НО - 0,5 г; (NH)SO - 0,7 г; целлюлоза порошковая в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза - 0,3 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 18 г; вода дистиллированная - до 1000 мл |
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования:
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20±5 °С), атмосферном давлении 630-800 мм рт.ст. и влажности воздуха не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента ксиланазы воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5-20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3-5 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Сусло-агар расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков из расчета 50 мкл на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры) и нистатина (10 мкг/мл для подавления грибковой флоры), тщательно перемешивают и разливают по 10-15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 30 °С. Через 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м воздуха производят по формуле:
кл/м,
где - концентрация клеток продуцента в воздухе;
- количество зон вокруг колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 м воздуха;
- объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N
количественного микробиологического анализа штамма
Penicillium canescens F-832 ВКПМ продуцента ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа |
|||||
2. Место отбора пробы |
|||||
3. Название лаборатории |
|||||
4. Юридический адрес организации |
|||||
Результаты микробиологического анализа
Шифр или N пробы |
Определяемый микроорганизм |
Концентрация, кл/м |
|
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
Список литературы
1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-89. М., 1991. 693 с.
2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
3. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.
Текст документа сверен по:
официальное издание
Методы контроля. Микробиологические факторы.
Методические указания: [Сборник]
(МУК 4.2.1767-03 - МУК 4.2.1775-03). -
М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2004
|