МУК 4.2.1054-01
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
3.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест.
Дата введения 2001-10-01
1. ПОДГОТОВЛЕНЫ: д.м.н. М.В.Далин (Российский Университет дружбы народов), к.м.н. Н.П.Сергеюк (Научно-исследовательский центр "ЭКОС") на основании материалов секции "Гигиенические аспекты биотехнологии микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной Комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды"
2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по госсанэпиднормированию Минздрава России (прот. N 7 от 28.04.01)
3. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 июня 2001 г.
4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентраций промышленных микроорганизмов и бактериальных препаратов в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне от 100 до 5000 клеток в 1 м3воздуха.
Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля концентрации промышленных микроорганизмов и бактериальных препаратов в атмосферном воздухе населенных мест и оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и 8.653-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
2. Характеристика штамма микроорганизма
2.1. Таксономическое положение штамма
2.2. Морфология колоний и клеток. (Данные по каждому штамму для п.п.2.1, 2.2 представлены в табл.)
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздушной среде в диапазоне концентраций от 10 до 5000 клеток в 1 м 3воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
5. Средства измерений, оборудование, вспомогательные устройства, материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) | ТУ 64-12791-77 |
Импактор микробиологический ИМБ-15 | |
Прибор для бактериологического анализа воздуха "Флора-100" | |
Термостаты электрические суховоздушные или водяные | |
Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами | |
Холодильник бытовой | |
Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 | |
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 | |
Лупа с увеличением 10х | ГОСТ 25706-83 |
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные, диаметром 100 мм | |
Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл | ГОСТ 10515-75 |
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл | ГОСТ 10515-75 |
Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл | ГОСТ 1770-74 |
Секундомер | ГОСТ 9586-75 |
Барометр | ГОСТ 24696-79 |
Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 25556-81 |
5.2. Питательные среды
Агар микробиологический | ГОСТ 17206-96 |
Селективная среда (среда для каждого штамма микроорганизмов представлена в табл.). |
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток в воздушной среде соблюдают следующие требования.
Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.
Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Проведение измерения
8.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации микроорганизма производят отбор проб воздуха при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время отбора пробы воздуха 20 мин. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. В том случае, если определяется концентрация микроорганизмов, имеющих обильный воздушный мицелий, отбор производят в жидкостные поглотители с последующим разведением и посевом на плотную питательную среду.
8.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3-4 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний.
Селективную среду тщательно перемешивают и разливают по 20 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. При необходимости в селективную среду добавляют компоненты, подавляющие рост посторонней микрофлоры. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37°С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри инкубируют в термостате и производят подсчет выросших типичных колоний. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
9. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток в перерасчете на 1 м3воздуха производят по формуле:
X=(N*1000)/V, кл/м3, где
X - концентрация клеток в воздухе;
N - количество колоний, выросших на чашке;
1000 - коэффициент перерасчета на 1 м3 воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
Для консорциумов микроорганизмов используют следующую методику подсчета:
A=100*N/d, где
A - концентрация консорциума (КОЕ/м3)
N - концентрация контрольного микроорганизма (КОЕ/м3)
d - содержание контрольного микроорганизма в консорциуме (%).
Контрольные микроорганизмы, входящие в состав консорциумов (препаратов, созданных на основе живых микроорганизмов и включающих в себя два и более штаммов), представлены в табл. с пометкой КМ, там же приведены торговые названия препаратов.
Используемые сокращения и условные обозначения
АС - Агаризованная среда
МПА - Мясо-пептонный агар
МСЭА - Агар с экстрактом мозга и сердца
РНСП - Роды с неясным систематическим положением
САС - Синтетическая агаризованная среда
ВЗ - Выброс запрещен
Пояснение к таблице
Микроорганизмы, сведения о которых представлены в табл., разделены на группы, не являющиеся формальными таксономическими категориями, но подразделяющие штаммы на легко определяемые фенотипические единицы.
Таксономическое положение каждого штамма определено до уровня семейства за исключением т.н. "Родов с неясным систематическим положением" согласно "Определителю бактерий Берджи" (М., "Мир", 1997).
Для каждого из штаммов микроорганизмов представлена селективная твердая питательная среда и специальные добавки в среду, необходимые для подавления посторонней микрофлоры.
Колонка "Примечания" содержит сведения об особенностях штамма как упрощающих его идентификацию (способность к образованию какого-либо пигмента, специфическая ферментативная активность и т.д.), так и создающих возможность экспресс-диагностики.
Таблица
Идентификация микроорганизмов и условия их культивирования
N п/п | ПДКaтм., кл/м3 | Таксономическое положение | Питательная среда (базовая) | Добавки в питательную среду для подавления посторонней микрофлоры | Условия культивирования (время инкубации и t,°C) |
Морфологические признаки колоний | Примечания |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
Грамотрицательные аэробные/микроаэрофильные палочки и кокки | |||||||
1 | 50 | Семейство: Neisseriaceae. Род: Аcinetobacter Вид: oleovorum s/paraffinicum шт. ВСБ 712 |
МПА | Спирт этиловый рект. 2 мл/100 мл среды | 1 сутки 38°C |
Круглые с ровным краем, блестящие, бесцветные, d - 3-4 мм | |
2 | 300 | Вид species шт. ВСБ 644 |
МПА | Спирт этиловый рект. 2 мл/100 мл среды | 3 суток 37°C |
Округлые, гладкие, слабо выпуклые, с ровным краем, светлые, d - З мм | |
3 | 500 | Семейство: Azotobacteriaceae Род: Azotobacter Вид: Vinelandii (Lipman) шт. Ф.ч-1 |
Мясная вода/МПА-1/1, пептон 10,0, натрий хлористый 5,0, глюкоза 10,0, агар 2,0, рН 7,2-7,4 | Амфотерицин 10 мкг/мл, стрептомицина сульфат 250 мкг/мл |
2-3 суток 28°C | Мелкие, выпуклые, плотные, маслянисто- блестящие, вросшие в агар | Синтезирует водорастворимый пигмент, флуоресцирующий в УФ-лучах |
4 | 200 | Семейство: Pseudomonaceae Род: Pseudomonas Вид: fluorescens шт. К3б |
МПА | Нафталин 2 мл/100 мл среды |
2 суток 28°C |
Полупрозрачные, глянцевые, слегка опалесцирующие, в центре небольшое уплотнение в виде точки, d - 1,4-2,2 |
При добавлении нафталина - темно-коричневая окраска |
5 | 2000 | шт. ST | МПА | Фенол, ацетон, стирол (2 мл/100 мл среды) | 2 суток 28°C |
Глянцевые, опалесцирующие d - 2 мм |
|
6 | 30 | Вид: stutzeri шт. 367-1 |
Картофельный агар | Низкомолекулярные спирты (кроме метанола) 2 мл/100 мл среды |
2 суток 32°C |
Светло-серые, круглые, в центральной части угристые, бежевые, край волнистый прозрачный | КМ, препарат "Деваройл" |
7 | 1000 | РНСП Род: Acetobacter Вид: methylicum шт. ВСБ-924 |
САС с метанолом |
Метанол 2 мл/100 мл среды (pН 4,5) |
3 суток 30-35°C | Выпуклые, гладкие, серовато-белые, слизистой консистенции | |
Грамположительные палочки и кокки, образующие эндоспоры | |||||||
8 | 200 | Семейство: Bacillaceae Род: Bacillus Вид: polymixa шт.- |
Различные агаризованные среды (белково- витаминный агар, кукурузо- пептонный агар) | Амфотерицин В (10 мкг/1 мл среды) либо Полимиксин М |
1 сутки 30-37°C | Круглые, в центре выпуклые, шероховатые, с лопастным краем, желтовато- сероватого цвета, d - 2-2,5 мм | |
9 | 200 | шт. F-12 | |||||
10 | 1000 | Bид: Subtilis шт. 265-76 |
|||||
Грамположительные неспорообразующие палочки правильной формы | |||||||
11 | 2000 | Семейство: Lactobacillaceae Род: Lactobacillus Вид: cazei шт. 21 |
Среда Рогози МПА | Желчь | 7-8 суток 30°C | Мелкие, круглые колонии. Глубинные колонии с выростими | КМ препарата "Байкал" |
Факультативные анаэробные грамотрицательные палочки | |||||||
12 | ВЗ | Семейство: Enterobacteriaceae Род: Esherihia Вид: соli. шт. 1864 |
Среда Эндо | Ампициллин 200 мкг/1 мл среды |
1 сутки 27°C |
Выпуклые, с блестящей поверхностью, ровными краями, легко эмульгирующие в солевом растворе, не пигментированные | ГИЖ |
13 | ВЗ | шт. 472-Т23 | |||||
14 | ВЗ | шт. ТДГ-6 | |||||
15 | ВЗ | шт. 436 | |||||
Актиномицеты и родственные микроорганизмы. Группа коринеформных бактерий | |||||||
Грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы | |||||||
16 | 100 | Семейство: Actinomycetaceae Род: Actinomyces Вид: rozeolus шт. Z-219 |
Кровяной агар МСЭА, среда Гаррода | 7-14 суток | "Паукообразная" колония с многочисленными ветвящимися нитями | Отбор в жидкостный поглотитель | |
17 | 3000 | Семейство: Corynebacteriaceae Pод: Corynebacterium Вид: glutamicum шт. ВКПМ-B5115 |
МПА | Грамицидин 10 мкг/мл среды |
3 суток 32°C |
Желтоватого цвета с ровным краем, d не более 5 мм | |
18 | 1000 | шт. ВСБ206-L | МПА | Грамицидин 50 мкг/мл | 3 суток 32°C |
Желтоватые или желтые с ровным краем, d - 5мм | |
19 | 5000 | Семейство: Brevibacteriaceae Род: Brevibacterium Вид: flavum шт. ВНИИ Генетика 50-72(ВКПМ-B37-57) |
Агар Хоттингера | 3 суток 32°С |
Серовато-белые или кремовые, круглые, выпуклые, с ровным краем, влажно блестящие, d - Змм | Для роста нуждаются в тиамине | |
20 | ВЗ | Вид: lactofermentum шт. НИТИА-89 | Агар Хоттингера | 3 суток 29-31°C | Твердые, крупные, кремового цвета | ||
Нокардиоформные актиномицеты | |||||||
21 | 200 | Семейство: Nocardiaceae Род: Nocardia Вид: mediterranii |
САС (Красильникова, Гаузе1) и органические АС | Амфотерицин В 5 мкг/мл |
8-12 суток 28°C | Крупные, чашевидные или плоские складчатые, крошащиеся. Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент на разных средах от зеленовато-бурого до ржавого или красновато- коричневого | Ускоренный метод основан на способности выделять рифамицин, который образует зоны задержки роста тест-культуры (St. Aureus 209 3) |
22 | 5000 | РНСП Род: Rhodoсoсcus Вид: eritropolis шт. 367-2, 367-6 |
АС Раймонда | Нефть или нефтепродукты 2 мл/100 мл среды |
4 суток 30-32°C |
Оранжевые или ярко-оранжевые, круглые, выпуклые с ровным краем, блестящие | КМ препарата "Деваройл" |
23 | 5000 | Вид: maris шт. 367-5 | Картофельный агар | Нефть или нефтепродукты 2 мл/100 мл среды |
4 суток 30-32°C |
Ярко-оранжевые, круглые, выпуклые с ровным краем, блестящие | КМ препарата "Деваройл" |
24 | 5000 | Вид: ruber шт.1418 (ВКМ Ас 1513 D)33 | Картофельный агар | 4 суток 30°C |
Красные, круглые, выпуклые, слизистые | ||
Актинопланы | |||||||
25 | 25 | Семейство: Micromonosporaceae Род: Micromonospora Вид: atratavinosa Sp. Nov. 1573 шт. 184 R |
САС Гаузе1 | Амфотерицин В 20 мкг/1 мл среды сизомицин 2000 мкг/мл среды |
10-12 суток 37°C |
Черные, выпуклые, со складчатой поверхностью, d - 3-5 мм, воздушного мицелия не образуют |
Черный или темно- коричневый пигмент |
26 | 500 | Вид: purpurea Var Violaceae | САС Гаузе1 | Амфотерицин В 10 мкг/мл среды |
10 суток 35°С | Поднимаются круто от поверхности среды, хорошо развит септированный мицелий | Розовый или розоватый пигмент |
Стрептомицеты и близкие к ним роды | |||||||
27 | 500 | Семейство: Streptomycetaceae Род: Streptomyces Вид: aureofaciens шт. 0,19 (8) |
Среда Хоттингера | Амфотерицин В 20 мкг/мл среды |
10-12 сут 28°C |
Обильный воздушный мицелий серого цвета. Колонии плоские, слабо складчатые, с кратером в центре | Отбор в жидкостный поглотитель |
28 | 500 | шт. STR 2255 | Округлые, выпуклые, серого цвета, с хорошо развитым воздушным мицелием, выделяют в среду темный пигмент | Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод - учет зон задержки роста тест-культуры Bac. Subtilis на агаре Хоттингера | |||
29 | 300 | Вид: cinnamonensis шт. НИЦБ 109 | ISP на основе агара Difco | Олеандомицин или линкомицин 15 мкг/мл среды |
3-4 сут 28°C |
Серо-белые, округлые, радиально- складчатые, с фестончатым краем и выпуклым более темным центром |
Отбор в жидкостный поглотитель |
30 | 300 | Вид: eritreus шт. 851 | Среда ЭР-1 | Эритромицина основание (фосфат) 250-500 мкг/мл среды | 10-14 сут 32°C |
Колонии с обильным воздушным мицелием, труднофрагмен- тируемым. Вегетативные гифы 0,5-2,0 мкм в диаметре |
Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на способности продуцировать антибиотик, который определяется по задержке зон роста тест-культуры (Bac. Subtilis 6633) |
31 | 500 | Вид: kanamyceticus | Среда Гаузе1 | Амфотерицин В 10 мкг/мл среды |
12 сут 28°C |
Округлые, плоские, d - 6 мм. Воздушный мицелий белый, обильный, субстратный - светло-коричневый | Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на способности продуцировать антибиотик, который определяется по задержке зон роста тест-культуры Bac. Subtilis ATCC 6633 (споры) |
32 | 500 | Вид: noursei шт.153/55 | Крахмально- аммиачная среда | Амфотерицин В 10 мкг/мл среды |
5 сут 27°C |
Белые с раздельной складчатостью, приподнятым центром, плоским волнистым краем. Воздушный мицелий серого цвета | Отбор в жидкостные поглотители |
33 | 300 | Вид: rimosus шт. 1-43 |
АС с кукурузным экстрактом и картофельным крахмалом | Амфотерицин В 20 мкг/мл среды |
8-12 сут 27°C |
Радиально складчатые, в центре - кратер, субстратный мицелий - коричневый, воздушный - светло-серый, хорошо развит |
Отбор в жидкостный поглотитель. Ускоренный метод основан на выделении в среду антибиотика и задержке зон роста тест-культуры (Bac. Subtilis вар. L2) |
34 | ВЗ | Род: Streptoverticillium Вид: griseocameum |
САС | Неомицин, лизоцим | 8 сут 25-30°C |
Небольшие обособленные, дымка воздушного мицелия бархатная или хлопьевидная, розовато-бежевого цвета с сиреневым оттенком | Отбор в жидкостные поглотители. Розовато- бежевый пигмент |
Микобактерии | |||||||
35 | 2000 | Семейство: Mycobacteriасeае Род: Mycobacterium Вид: species шт. В 3805 |
Кукурузно- мучной глицериновый агар | 7 сут 35-40°C | Воздушного мицелия не образует | Возможно образование пигмента | |
Грибы и дейтеромицеты | |||||||
36 | 500 | Род: Acrimonium Вид: chrizogenum шт. 298-А |
АС/обрат, 1/1 | Стрептомицин 500 мкг/мл среды |
9-11 суток 28°C | Выпуклые, правильно- складчатые, белого цвета, с зубчатыми краями |
Ускоренный метод основан на способности выделять протеазу, которую выявляют по образованию зон просветления среды вокруг колоний |
37 | 200 | Род: Candida Вид: Famata шт. ВСБ-641 |
Сусло-агар | Дрожжевой гидролизат. Стрептомицин 50 ЕД/1 мл среды |
2-3 суток 32-34°C | Однородные, гладкие, белые, с ровным краем | При посеве по трубочкам Эйнгорна с дрожжевой водой и глюкозой брожения нет |
38 | 20 | Вид: lipolitica шт. 367-3 | Картофельный агар, МПА, сусло-агар, минеральная среда Раймонда | Нефтепродукты 2 мл/100 мл среды |
2 суток 30-32°C | Беловатые, матовые, плоские, край волнистый, образует псевдомицелий | Отбор в жидкостные поглотители, КМ препарата "Деваройл" |
39 | 100 | Вид: tropicalis шт. ВСБ-928 |
Картофельный агар САС | З суток 30°C |
Круглые, беловатые, на 3-4 день псевдомицелий | Отбор в жидкостные поглотители | |
40 | 100 | Вид: Utilis шт. ВСБ-651 |
Картофельный агар, сусло-агар | 2 суток 30°C |
Белые, матовые, образует псевдомицелий | Отбор в жидкостные поглотители | |
41 | 500 | Род: Fuzidium Вид: coccineum шт. 108 |
Сусло-агар, среда N 9 (ГФ Х) | Амфотерицин В 10 мкг/мл среды | 9-14 суток 24°C | Круглые, складчатые, серовато-розовые с белым, слегка фестончатым краем, мицелий выражен слабо | Ускоренный метод основан на выделении фузидиевой кислоты, подавляющей рост тест-культуры (Вас, Мyсоides HB2) |
42 | 500 | Род: Penicilium Вид: chrisogenum |
Агаризованная среда Чапека, Райстрика | Канамицин 25-50 мкг/мл среды (неомицин, сизомицин) |
9-10 суток 24°C | Бежевые, складчатые, центр приподнят, края неровные, обратная сторона светло-коричневая | Ускоренный метод основан на выделении бензилпенициллина, подавляющего рост тест-культуры (St. Aureus 209 P) |
43 | 500 | Семейство: Entomophtorасеае Род: Entomophtorа | Сабуро- декстрозный агар | Карбенициллин 150 мкг/мл среды, амфотерицин - 10 мкг, полимиксин М 250 мкг |
4-5 суток 25°С | Округлые, складчатые, приподнятые к центру, серовато- кремового цвета |
|
44 | 200 | Род: Рichia Вид: membrana faciens |
Кукурузный агар | 3 суток 30-34°C | Кремовато-серого цвета, бархатистые, край лопастной, поверхность мучнистая, хорошо развитый ветвящийся псевдомицелий | Отбор в жидкостные поглотители | |
45 | 500 | Род: Trichoderma Вид: reesei шт. NIBT 18.2-33 |
Сусло-агар | Карбенициллин 150 мкг/мл среды | 4-5 суток 28-30°С | Круглые, с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, край волнистый, образует мицелий | Отбор в жидкостные поглотители. Выделяет ярко-желтый пигмент |
|